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山羊关节炎-脑炎(Caprine Arthritis Encephalitis,CAE)是由反转录病霉科慢病毒属山羊关节炎-脑炎病毒(Caprine Arthritis Encephalitis Virus,CAEV)引起的山羊的慢性传染病。CAE的典型症状是山羊羔脑脊髓炎和成年山羊多发性关节炎、硬结性乳房炎以及间质性肺炎。该病呈全球分布,英国、美国等发达国家更为严重,我国于1982年进口种山羊时传入本病,该病对山羊种群造成的经济损失是惨重的。但是目前,对该病的预防与控制仍是世界各国所面临的难题。为了在我国更好地预防和控制本病的发生和流行,建立一种快速、简单、可靠的检测CAEV的诊断方法,本试验在大肠杆菌中诱导表达了CAEV p28特异性蛋白,并用该蛋白作抗原建立了间接ELISA检测方法,用该方法对100份本室保存血清进行了检测。 首先使用山羊关节滑膜细胞成功繁殖了山羊关节炎-脑炎病毒后,参照GenBank发表的基因序列,设计合成一对带有酶切位点的引物,对CAEV甘肃株p28基因进行PCR扩增,并进行了分子克隆,利用pET表达载体成功实现了p28基因在大肠杆菌中的表达。重组蛋白氨基端带有6个组氨酸标签,利用固定化金属离子亲和层析法进行纯化,免疫印迹试验证明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白作为诊断抗原建立了间接ELISA诊断方法,确定其最佳工作条件为重组抗原每孔包被0.1μg,阳性血清以1:50倍稀释,辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG(HRP-兔抗山羊IgG)以1:1000倍稀释,HRP-兔抗山羊IgG最佳作用时间为2h,判定标准为P/N值人于2,且OD值在1.0左右的血清为阳性,否则判为阴性;同时用纯化的p28蛋白免疫小鼠,制备阳性血清。利用重组蛋白抗原检测3只CAEV攻毒后山羊血清抗体水平时发现,3只山羊均在接种2周后可产生p28蛋白的相应抗体,此抗体一直持续存在且滴度较高。在分别以p28蛋白做抗原的琼脂糖免疫扩散试验(AGID)结果和间接ELISA试验结果对比中发现,攻毒山羊在接种5周后用两种方法都可检测到血清抗体,但琼扩方法检测到抗体的最早时间比ELISA方法检测到抗体的最早时间要迟3周,而且琼扩方法在检测攻毒后第6个月山羊血清时为阴性,而ELISA方法检测结果为阳性,一方面说明表达的p28蛋白抗原性好,另一方面也说明用琼扩方法能够检测到的p28抗体水平要比ELISA方法能够检测到的p28抗体水平高,ELISA诊断方法比琼扩诊断方法有高的敏感性。重组抗原在实际应用中共检测100份血清样品,67份抗体检测呈阳性。 我们知道CAEV能够在山羊关节滑膜、胎肺、眼角膜细胞上繁殖,但最近国外有报道称:CAEV在山羊卵巢颗粒细胞上也能够繁殖,而且山羊卵巢颗粒细胞经常被用于体外卵母细胞成熟,同时几乎所有的工业化国家山羊种群都高度感染CAEV,而且许多不明来源的卵母细胞被用作体外山羊胚胎生产,所以我们认为作为饲养层细胞的颗粒细胞可能是山羊胚胎感染CAEV的主要来源,因此,颗粒细胞能否被CAEV感染是我们确定山羊胚胎感染CAEV的途径提供一条新的线索。为此,本研究进行了CAEV在山羊卵巢颗粒细胞上的感染性试验。对山羊卵巢颗粒细胞进行原代培养,传代2-3代以后,接种CAEV,观察细胞病变,提取病变细胞核酸后,用设计好的的针对CAEV p28基因的引物进行PCR扩增,扩增出一条660bp的片段,经过序列分析后,确定为p28基因,证明CAEV基因组已整合到颗粒细胞基因组上;用上面试验中制备的p28蛋白免疫小鼠获得的阳性血清对病毒在颗粒细胞上的培养物进行CAEV特异性蛋白的免疫印迹试验,发现培养物中有CAEV特异性p28蛋白,证实整合到颗