无乳链球菌(Sagalactiae)不仅能引起动物乳房炎，还能引起人的多种感染。对这些感染过去人们一直采用抗生素治疗，但由于抗生素具有许多副作用，并不断导致无乳链球菌耐药菌株产生，使抗生素治疗无乳链球菌感染受到了限制。因而促使人们寻求新的防制无乳链球菌感染方法。研究证实，无乳链球菌Sip蛋白作为抗原免疫小鼠，能提供良好的免疫保护效果。但有关Sip蛋白对无乳链球菌引起的动物乳房炎是否具有保护作用，尚不清楚。因此，本研究使用表达的Sip重组蛋白制备抗原，免疫奶山羊后研究其对无乳链球菌性乳房炎的免疫保护作用，为进一步研究开发无乳链球菌基因工程疫苗提供参考。 本研究从患乳房炎的奶牛乳汁中分离到1株链状球菌，并进行培养特性、生化特性、致病性等鉴定和药敏试验。结果，该菌株在血琼脂培养基上长成淡灰白色、隆起、闪光的小菌落，呈p溶血；在脑心浸出液(BHI)中培养，初期表现为均匀混浊，随着培养时间延长，在管底出现沉淀；在6.5％NaCI的BHI中不生长；镜检为革兰氏阳性球菌，呈长链状排列；山梨醇、甘露糖、七叶苷和棉实糖酵解试验阴性，乳糖、水杨苷和马尿酸钠酵解试验阳性；对试验所使用的青霉素G、复方新诺明、红霉素等12种抗生素均不敏感；将该菌株经乳房人工感染泌乳奶山羊，可引起乳房发生急性炎症，产奶量下降，CMT检测阳性甚至强阳性，乳汁SCC升高，乳汁成分发生变化，同时伴有体温升高、心跳加快等全身症状。以上结果表明该菌株为致病性无乳链球菌。 按照GenBank中的sip基因序列，利用DNAStar软件分析，设计一对引物。从分离菌株中扩增获得sip基因。将sip基因插入到pET-32a(+)表达载体中，并转化到Ecoli BL<,21>(DE3)，经筛选获得pET-sip重组菌，表达后对其进行测序分析。结果，所扩增的核酸序列与GenBank中提供的sip基因序列相比，核苷酸和氨基酸同源性均为98％。说明sip基因高度保守。进一步对重组菌进行IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析。结果与对照菌株相比，诱导后的pET-sip表达约为71 kDa、含有6个组氨酸标签的融合蛋白。经抗组氨酸标签抗体进行westem-blotting分析证实，表达的融合蛋白为目的蛋白。 利用重组蛋白上6个组氨酸残基能与Ni<2+>结合的特性，用MagneHis蛋白纯化系统对Sip重组蛋白进行纯化，得到单一的目的蛋白。将纯化后的Sip重组蛋白浓缩，并用弗氏佐剂乳化后，按3mg/羊的剂量皮下多点注射免疫5只奶山羊，并以等量生理盐水免疫3只奶山羊作对照。间隔两周再加强免疫1次。二免后两周，每只奶山羊一侧乳头管内注射无乳链球菌2×10<6>CFu，观察7天。结果，未免疫组奶山羊全部发病，乳房出现红、肿、热、痛、触之坚实等症状，乳汁由乳白色转变为黄绿色，并出现浆液性液体，内含少量凝乳块；CMT检测为强阳性；乳汁SCC升高，最高达630.7±72.5万/mL；乳汁成分改变；乳汁细菌学检查在接菌侧乳汁中均检出原接种细菌。而免疫组奶山羊均未见发病，两侧乳房均未出现上述变化，乳汁细菌学检查两侧乳房乳汁中均未检出原接种细菌，免疫保护率为100％.上述结果表明，表达的Sip蛋白可以对无乳链球菌性乳房炎提供良好的免疫保护。