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【研究背景与实验目的】肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球性的健康问题,具有发病率高,死亡率高的特征,严重威胁人类的健康。孤立的小肝癌通常首选外科手术治疗,五年存活率可达50%以上。但肝癌发病隐匿,患者确诊时一般已达中晚期,仅有部分患者有机会接受肝移植,仍有许多患者需要接受传统化疗或近年新兴的基因治疗、靶向药物治疗和免疫治疗。众所周知,传统化疗药物的选择性低,毒副作用强;免疫治疗更是对实体肿瘤,尤其是肝细胞癌的疗效不佳。除此之外,接受手术治疗后的患者仍有70%以上的概率出现肝内播散或是肝外转移,使得肝癌的术后复发成为困扰医务工作者的另一大难题。近年来,随着诸如索拉菲尼和伊马替尼等靶向药物的加入,传统肝癌治疗的方式被拓宽到局部结合系统治疗,肝癌的药物治疗正被逐步优化。基于肿瘤是一种多基因改变和信号通路传导异常的疾病,更多的生物分子有望成为治疗靶点,且亟待研究,以此提高肝癌患者的治疗效果和总体生存。细胞因子信号传导抑制因子1（Suppressors of cytokine signaling 1,SOCS1）基因是SOCS蛋白家族中的一员,所有成员在结构上十分相似,均具有N末端区域、SH2区和SOCS盒结构域,可分别参与到信号蛋白的磷酸化过程和靶蛋白的泛素-蛋白酶体途径中。SOCS1在多种肿瘤中被报道为抑癌因子,并在肝癌中存在异常甲基化,但其在肝癌中的具体作用机制研究仍旧局限,尤其是针对肝癌细胞周期调控的机制值得探索。【研究内容与方法】本研究拟通过两部分实验阐释SOCS1在肝癌中的作用和机制:1.明确SCSO1在人肝癌组织及癌旁正常组织和肝癌细胞系中的表达水平,结合临床病理数据统计分析SOCS1对肝癌诊断和预后评估的价值。（1）运用Oncomine国际数据库收集SOCS1在正常肝脏、肝硬化组织和肝癌组织中的m RNA表达量,分析比较正常组与异常组的表达水平差异;（2）运用实时荧光定量聚合酶链式反应检测SOCS1在159例肝细胞癌患者的肝癌组织及匹配癌旁正常组织的m RNA表达水平;（3）运用免疫组织化学染色法检测SOCS1在90例肝细胞癌患者的肝癌组织及匹配癌旁正常组织的蛋白表达水平;（4）选取正常肝脏细胞系QSG-7701和七种肝癌细胞系（SMMC-7721、HPEG2、HEP3B、HUH7、HCC-LM3、MHCC-97H和SK-HEP-1）验证SOCS1在细胞系中表达趋势与肝癌组织的一致性;（5）运用Kaplan–Meier生存分析和log-rank检验分析SOCS1表达与肝细胞癌患者预后的关系;运用卡方检验分析SOCS1表达与患者临床病理数据的相关性。2.探索SOCS1在肝细胞癌细胞周期调控中的作用和机制,寻找肝癌增殖进展的理论依据,发掘肝癌治疗的新型潜在靶点。（1）使用慢病毒转染,构建稳定过表达SOCS1的SMMC-7721、HCC-LM3和MHCC-97H人肝癌细胞株,蛋白质印迹实验验证过表达效率;（2）使用高通量测序技术分析转录组基因差异表达,富集SOCS1潜在影响的信号通路;运用CCK-8、流式细胞术周期检测和Ed U实验检测SOCS1对肝癌细胞周期的具体作用,并锁定关键调控节点采用蛋白质印迹实验印证;（3）使用稳定过表达SOCS1的SMMC-7721细胞株和对照组细胞建立裸鼠异种移植肿瘤,观察SOCS1在体内对肿瘤生长的影响;运用免疫组织化学染色,进一步验证上述所得关键调控蛋白的表达水平;（4）结合测序结果,分析差异表达蛋白的调控途径。分离提取细胞质和细胞核蛋白,检测核内关键蛋白表达水平;加入放线菌酮药物检测蛋白降解半衰期;运用Co-Immunoprecipitation（Co-IP）实验证实蛋白互做中的结合关系;过表达关键调控分子的表达量,观察其对下游信号通路的逆转;运用STRING蛋白互做数据库分析所得蛋白是否存在确切关联。【结果】1.肝癌细胞系、肝癌组织中SOCS1的m RNA和蛋白质表达水平较之正常肝癌细胞系和癌旁正常组织低表达（P<0.0001）;2.SOCS1与临床病理数据分析发现,SOCS1的表达水平与肿瘤大小相关（P=0.02）,且高表达SOCS1患者组较之低表达组拥有更高的无瘤生存率（P=0.0042）和总体生存率（P=0.0265）;3.高通量测序分析差异基因并富集信号通路,发现SOCS1与细胞周期和泛素化途径存在相关性,提示肝癌中可能存在SOCS1调控细胞周期关键分子的泛素化修饰从而抑制肝癌细胞增殖的信号通路;4.过表达SOCS1后,SMCC-7721,HCC-LM3和MHCC-97H的细胞扩增速率显著下降（P<0.0001）;HCC-LM3和SMCC-7721细胞株的细胞周期阻滞在G1期（P<0.05）,S期细胞占比显著减少（P<0.005）,MHCC-97H细胞株并未观察到明显的周期阻滞;Ed U实验证实HCC-LM3和SMCC-7721两种细胞株在过表达SOCS1后存在细胞周期的G1-S期转化阻滞;5.细胞周期G1期的关键调控分子Retinoblastoma（Rb）的磷酸化水平在SOCS1过表达后显著下调,阻断细胞周期进展。另一关键调控分子Cyclin D1蛋白质表达水平升高,其上游P21和P27的蛋白质表达水平下调;6.体内实验中,过表达SOCS1的SMCC-7721细胞株生长受到明显抑制,成瘤大小显著小于对照组（P<0.001）;肿瘤组织切片运用免疫组织化学染色证实关键调控蛋白分子差异表达与上述结果一致;7.SOCS1过表达后P21和P27的转录水平未受到明显改变,通过MG-132药物的时间梯度实验,提示P21存在泛素化修饰的可能,并通过Co-IP证实P21受泛素化调节,进而影响Cyclin D1/CDK4复合体在细胞核内稳定性;8.分离提取细胞质和细胞核蛋白后运用蛋白质印迹检测,发现SOCS1过表达后核内发挥作用的Cyclin D1蛋白总量下调,包含了更多失活的Phospho-Cyclin D1,无法正常结合CDK4;9.过表达SOCS1后的稳定转染细胞株,再经P21的过表达,可以将上述细胞周期信号通路的差异表达逆转,减少Cyclin D1在核内的失活量,利于稳定Cyclin D1/CDK4复合体;10.Co-IP实验进一步证实CDK4所能结合的Cyclin D1蛋白量在SOCS1过表达后显著减少;SOCS1与泛素连接酶E3复合体中的Ring-box 1（RBX1）存在结合关系,可募集泛素转移酶E2促进靶标蛋白经泛素-蛋白酶体途径降解。【结论】1.SOCS1在肝癌细胞和患者肝癌组织中低表达,且与肿瘤大小存在相关性。2.通过高通量测序分析和实验论证,在肝癌中发现SOCS1可以有效调控P21-Cyclin D1/CDK4-Rb细胞周期信号通路。3.SOCS1在肝癌中有明确的抑癌作用,通过细胞周期阻滞可以抑制肝癌的发展,在细胞周期信号网络中发挥了重要作用,可能作为潜在靶点治疗肝癌。