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背景与目的:miR-184-U（突变型的miR-184,r.57c>u）在多种家族性遗传性眼病中被发现,但在这些眼部疾病中,miR-184-U的生物学功能和致病机制仍不清楚。既往的研究表明circRNA可以作为某些miRNA的海绵,但是目前尚无研究探讨miRNA或其突变体是否会影响circRNA的表达。因此,本研究通过使用化学合成的miR-184-U模拟体及miR-184-C（野生型的miR-184）模拟体转染人晶状体上皮细胞后,对各组细胞的全转录组m RNA/circRNA进行测序,并进行数据分析和实验验证,以初步探究miR-184-U的生物学功能和在眼部疾病中的致病机制。既往的研究证实,RNA的末端结构会影响其功能,但目前针对平末端双链RNA的研究却很少。随着化学合成的RNA应用在越来越多的领域,尝试调整RNA结构,以期获得新的生物学功能的探索也越来越多。因此,我们设计了一种新的平末端双链RNA（dsRNA-184-U）,其序列与miR-184-U类似,种子区域含有U碱基,但其3’端无碱基外伸,并在晶状体上皮细胞中研究其生物学功能,以探索改变RNA的末端结构是否使其获得新的作用靶点和功能。视网膜新生血管性疾病严重危害视力和眼健康。既往的研究表明,多种miRNA在眼部新生血管形成的机制和调控中发挥着重要作用,miRNA潜在的治疗作用正受到学术界和生物技术公司的特别关注。我们前期的研究发现miR-184-U和dsRNA-184-U均可降低细胞内ATP水平,而新生血管的形成需要消耗大量ATP,因此我们设计了动物实验,以探究二者对视网膜新生血管的影响。方法:在第一部分的实验中,通过使用两个不同的RNA文库,我们对用miR-184-C,miR-184-U和阴性对照处理的晶状体上皮细胞的完整转录组m RNA/circRNA进行了测序。为了鉴定受miR-184-U影响的新基因,我们对数据进行了整合分析,并采用RT-q PCR和WB的方法对miR-184-U组和对照组间显著差异表达的基因进行验证。通过流式细胞术检测各组细胞的凋亡水平。根据验证结果,在第二部分的实验中我们检测了miR-184-U、dsRNA-184-U及对照RNA转染后,细胞内ATP的水平。通过荧光素酶报告实验检测miR-184-U和dsRNA-184-U的靶标基因。利用RNA下拉实验和质谱分析检测dsRNA-184-U与细胞内蛋白质的直接相互作用。通过免疫荧光法原位检测目标蛋白的表达和定位,并通过膜蛋白和胞质蛋白分离提取后分别进行WB检测的方法验证目标蛋白的转移。最后通过计算机软件预测的方法,我们模拟了dsRNA-184-U与目标蛋白的直接相互作用。在第三部分的实验中,我们使用氧诱导的视网膜病模型小鼠,检测玻璃体腔注射miR-184-U和dsRNA-184-U对视网膜新生血管的影响。使用FITC-dextran荧光造影在视网膜铺片中显示视网膜血管,并通过计算机图像分析对新生血管团面积进行定量。结果:miR-184-U处理的HLE细胞和miR-184-C处理的HLE细胞之间存在16个显著的差异表达基因（DEG）。miR-184-C组和NC组之间有47个显著的DEG。miR-184-U组和NC组之间有63个显著的DEG。与野生型miR-184-C相比,miR-184-U下调基因的范围更广泛。miR-184-C、miR-184-U和NC三组之间的细胞凋亡率没有显著差异。miR-184-U可以降低ALDH5A1和GABRA3的m RNA和蛋白质表达水平,这两个基因均与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路相关。在单个细胞类型中,circRNA表达模式显示为全局可变。在我们的实验条件下,总circRNA表达和circRNA的染色体起源数目似乎也是随机的。这些miRNA与circRNA之间的相互作用是相容的,而不是排他的。circRNA在ALU序列中较丰富,并具有miR-184-C和miR-184-U结合位点。dsRNA-184-U和miRNA-184-U均可以下调人晶状体上皮细胞中ALDH5A1和ATP的水平。miRNA-184-U可以和ALDH5A1 m RNA的3’UTR直接结合,而dsRNA-184-U则不能。dsRNA-184-U双链和DHX9之间存在物理相互作用,同时dsRNA-184-U p2（dsRNA-184-U的一条单链）和ATP5A及PKM2之间也存在物理相互作用。过表达的dsRNA-184-U可以直接作用于ATP5A,使其从膜释放到胞质中。与对照组相比,miR-184-U组的新生血管团面积占视网膜总面积的比例显著降低,而dsRNA-184-U组的新生血管团面积占视网膜总面积的比例尽管有降低的趋势,但并未达到统计学显著水平。结论:HLE细胞中miR-184-U的过表达直接抑制了ALDH5A1的表达,间接下调了GABRA3的表达,其作用靶点可能为丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路,并可能进一步影响三羧酸循环,这为理解与miR-184-U相关的眼病的进展机制提供了新的视角。dsRNA-184-U和miRNA-184-U下调ALDH5A1表达和降低ATP产生的机制是不同的。miRNA-184-U与ALDH5A1 m RNA的3’UTR结合并沉默其表达,可能通过影响三羧酸循环来减少ATP产生。而DHX9可能作为dsRNA-184-U的双链识别因子,将dsRNA-184-U的双链解旋成单链。释放后的单链（种子区域包含U碱基）与ATP5A相互作用,导致ATP5A从线粒体膜释放到细胞质。这可能导致了ATP合酶活性受损,因而ATP的产生减少,并间接减少了ALDH5A1表达。dsRNA-184-U为调节ATP合酶活性提供了一种新的可能的机制,并可能有助于发现调节ATP异常表达的治疗药物。玻璃体腔注射miR-184-U可以显著抑制视网膜新生血管生成,可能的机制是通过干扰血管内皮细胞ATP的生成而影响其增值和迁移,进而抑制新生血管产生。dsRNA-184-U虽然也能抑制细胞内ATP的生产生,但可能由于抑制程度低于miR-184-U以及动物体内环境的复杂干扰因素,而没有在本实验中显著抑制新生血管的产生,但对于其他ATP失调导致的疾病dsRNA-184-U可能仍然具有潜在的临床应用价值。我们的这一推测还需要进一步的体内外实验验证。