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蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)是引起反刍动物的虫媒传染病——蓝舌病(Bluetongue,BT)的病原,已鉴定出1~5、7、9、12、15、16、24等11个血清型,其中1型和16型是我国主要流行的血清型。IFIT家族也称ISG56家族,是一类干扰素诱导基因,包括IFIT1、IFIT2、IFIT3和IFIT5四个成员。动物在正常生理条件下,IFIT家族基因在机体内表达量较低,但在病毒等病原感染时IFIT家族基因的表达量会显著升高,通过识别病毒核酸或蛋白而参与调节细胞的先天性免疫应答,从而增强细胞的抗病毒能力。然而,目前未见牛、羊IFIT1及其抗蓝舌病病毒作用的相关报道。本研究拟克隆牛和羊IFIT1基因,对其进行序列分析,然后构建真核表达质粒,以实现IFIT1基因的真核表达,评价牛、羊IFIT1蛋白在BTV复制中的作用。(1)牛、羊IFIT1基因的克隆和序列分析参考GenBank已公布的IFIT1基因序列,设计引物,分别从BTV感染的牛肾源细胞系(MDBK)和绵羊原代睾丸细胞(PST)提取细胞总RNA,通过RT-RCR扩增获得预期大小的目的基因,将其与pMD18-T载体进行连接后测序,使用生物信息学软件将牛、羊IFIT1基因与已发表的其他多个物种的IFIT1基因序列进行对比分析。结果显示,克隆的牛、羊IFIT1基因与牦牛、藏羚羊、山羊、羊驼、骆驼、野猪、大熊猫、马和人IFIT1基因的同源性都在65%以上,牛IFIT1和羊IFIT1的同源性也高达86%;遗传进化树分析表明,牛、羊IFIT1基因与牦牛、藏羚羊、山羊、羊驼、骆驼等反刍动物IFIT1基因处于同一分支,而与马和人的IFIT1基因的遗传关系较远。(2)牛、羊IFIT1基因的真核表达及其对BTV增殖的影响设计表达引物,将测序正确的牛、羊IFIT1基因分别亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组表达质粒pcDNA3.1-BO-IFIT1和pcDNA3.1-OV-IFIT1,将其分别转染BHK21细胞,Western-blot和免疫荧光试验(IFA)验证目的蛋白的表达情况,并对成功表达的质粒转染细胞后接种BTV通过Western-blot试验、实时定量PCR、蚀斑分析检测IFIT1过表达对BTV病毒增殖的影响。结果显示:牛、羊IFIT1基因均能在真核细胞中有效表达;过表达IFIT1蛋白明显抑制BTV在细胞中的增殖,BTV NS1蛋白的表达水平和病毒滴度分别下降;相对定量PCR分析显示BTV感染MDBK(牛肾源细胞)和PST(绵羊原代睾丸细胞)后IFIT1基因的表达量显著上升。研究表明,牛、羊IFIT1在抗蓝舌病病毒感染中扮演重要作用。