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世界上大多数绵羊是季节性发情动物，多数以产单羔为主，随着肥羔生产成为羊产业的主导生产方式，产羔数性状的分子标记成为研究的热点。BMP-IB基因的一个位点被确定为用于澳大利亚的布鲁拉美利奴羊和中国的小尾寒羊产羔数的分子标记，但是在其他品种的产羔数检测中未能取得理想结果。新疆是我国绵羊品种资源最丰富的地区，多个绵羊品种或遗传资源群体表现出高繁殖力，一胎平均产羔2-4只，可作为研究绵羊高繁殖力遗传机制的理想样本。本研究以新疆本地多羔绵羊群体和田羊和单羔品种巴什拜羊为主要研究对象，采用SLAF-seq技术从全基因组中综合筛选可能引起产羔数差异的单核苷酸多态性(SNP)。通过全基因组关联研究，发现了与绵羊产羔数相关的新基因，并研究性状形成机制，为揭示绵羊繁殖力的调控机制提供了新的线索。试验研究结果具体如下：
1、和田羊产羔数性状的简化基因组关联分析
选取多羔性状绵羊品种和田羊62只和单羔品种巴什拜羊64只，提取其基因组DNA，通过SLAF-seq技术共鉴定出685300个SNPs可用于后续全基因组分析，利用一般线性模型和混合线性模型分析出新疆高繁殖力和田羊与低繁殖力巴什拜羊之间共存在155个显著关联的SNPs。通过显著的SNP位点注释定位在133个差异基因上；经基因功能注释与功能预测分析，筛选出14个与绵羊繁殖相关的差异基因(COIL、SLK、FSHR、Plxna3、Ddx24、CXCL12、Pla2g7、ATP5F1A、KERA、GUCY1A1、LOC101107541、LOC101107119、LOC101107809、BRAF)。
2、差异基因多态性及其与产羔数关联分析
经上述GWAS鉴定出的14个与繁殖有关的差异基因中，基于前人报道和功能预测分析，对7个基因与调控排卵和产羔的差异基因(CXCL12、FSHR、SLK、GUCY1A1、COIL、LOC101107541、LOC101107119)30个位点对来自新疆地区5个多羔绵羊品种(和田羊128只，阿勒泰羊65只，多浪羊16只，策勒黑羊44只，吐鲁番黑羊240只)进行KASP大群验证，其中4个基因9个位点KASP分型成功。将分型成功的基因型与和产羔数关联分析，最终确定FSHR(g.75320741)、GUCY1A1(g.43266624)以及COIL(g.7321466)3个基因3个位点与产羔数极显著或显著相关。这三个位点有望作为新疆绵羊产羔数显著的分子标记。
3、差异基因组织表达分布分析
对前期鉴定出的与排卵和产羔相关的7个基因在不同组织的表达验证结果表明：该7个基因在各组织中均有所表达，并且除LOC101107541基因外的6个基因在繁殖部位的mRNA表达量均高于内脏组织，其中CXCL12、GUCY1A1、SLK、COIL基因在子宫中的表达量最高，极显著高于内脏组织(P＜0.01)；FSHR基因在卵巢中的表达量最高，极显著高于其余7个组织(P＜0.01)。由此提示CXCL12、FSHR、SLK、GUCY1A1、COIL、LOC101107119基因均在子宫和卵巢中高表达，说明这些基因的表达分布主要在卵巢和子宫的繁殖器官中，参与繁殖效应。
4、COIL、GUCY1A1基因克隆、生物信息学及功能分析
运用克隆测序的方法，获得绵羊COIL基因CDS区全长1764bp，GUCY1A1基因CDS区全长2124bp，分别编码571、701个氨基酸。对COIL和GUCY1A1基因进行生物学信息分析，对其结构、理化性质和功能进行预测。推测COIL、GUCY1A1基因整个肽链亲水性和疏水性氨基酸分布较为均匀，但总体表现为较强的亲水性，均为亲水性蛋白，可促使蛋白聚合沉淀，且蛋白无跨膜区域，属于非跨膜蛋白，则促使其与受体结合从而进行生化活动。两个基因含有不同数量的潜在糖基化位点和磷酸化位点影响其蛋白翻译过程的运输和定位，从而更有利于繁殖机制的调节。
5、COIL基因在细胞中过表达及干扰研究
成功构建过表达载体pcDNA3.1-MHY-COIL，经双酶切和测序验证构建载体成功；设计干扰SiRNA序列，通过验证筛选出干扰效率最佳的序列。在小鼠卵巢纤维细胞和绵羊成纤维细胞中成功转染过表达载体和干扰序列，通过荧光定量和WB验证转染成功。通过细胞增殖和活性检测表明，COIL基因可以显著的提高小鼠卵巢纤维细胞和绵羊成纤维细胞中的增殖和活性，推测COIL基因在激活细胞增殖调控途径的同时，也提高了细胞的活性。将转染成功的绵羊成纤维细胞，通过荧光定量PCR来检测COIL基因对其互作蛋白的影响，结果显示当COIL过表达时，FBL、ATXN1、WRAP53、USPL1基因的表达活性极显著上升；当COIL基因干扰表达时，SMN7和Gemin2基因的表达活性极显著上升，说明与COIL基因呈现相反作用。
通过SLAF-seq技术，对产羔数不同的绵羊进行了全基因组关联分析，经过基因的分型和特异性表达实验证明，得出与产羔数相关的三个遗传标记，根据基因的功能预测和细胞实验，验证其多羔性状形成的机制，为揭示绵羊繁殖力的调控机制提供了新的线索。
1、和田羊产羔数性状的简化基因组关联分析
选取多羔性状绵羊品种和田羊62只和单羔品种巴什拜羊64只，提取其基因组DNA，通过SLAF-seq技术共鉴定出685300个SNPs可用于后续全基因组分析，利用一般线性模型和混合线性模型分析出新疆高繁殖力和田羊与低繁殖力巴什拜羊之间共存在155个显著关联的SNPs。通过显著的SNP位点注释定位在133个差异基因上；经基因功能注释与功能预测分析，筛选出14个与绵羊繁殖相关的差异基因(COIL、SLK、FSHR、Plxna3、Ddx24、CXCL12、Pla2g7、ATP5F1A、KERA、GUCY1A1、LOC101107541、LOC101107119、LOC101107809、BRAF)。
2、差异基因多态性及其与产羔数关联分析
经上述GWAS鉴定出的14个与繁殖有关的差异基因中，基于前人报道和功能预测分析，对7个基因与调控排卵和产羔的差异基因(CXCL12、FSHR、SLK、GUCY1A1、COIL、LOC101107541、LOC101107119)30个位点对来自新疆地区5个多羔绵羊品种(和田羊128只，阿勒泰羊65只，多浪羊16只，策勒黑羊44只，吐鲁番黑羊240只)进行KASP大群验证，其中4个基因9个位点KASP分型成功。将分型成功的基因型与和产羔数关联分析，最终确定FSHR(g.75320741)、GUCY1A1(g.43266624)以及COIL(g.7321466)3个基因3个位点与产羔数极显著或显著相关。这三个位点有望作为新疆绵羊产羔数显著的分子标记。
3、差异基因组织表达分布分析
对前期鉴定出的与排卵和产羔相关的7个基因在不同组织的表达验证结果表明：该7个基因在各组织中均有所表达，并且除LOC101107541基因外的6个基因在繁殖部位的mRNA表达量均高于内脏组织，其中CXCL12、GUCY1A1、SLK、COIL基因在子宫中的表达量最高，极显著高于内脏组织(P＜0.01)；FSHR基因在卵巢中的表达量最高，极显著高于其余7个组织(P＜0.01)。由此提示CXCL12、FSHR、SLK、GUCY1A1、COIL、LOC101107119基因均在子宫和卵巢中高表达，说明这些基因的表达分布主要在卵巢和子宫的繁殖器官中，参与繁殖效应。
4、COIL、GUCY1A1基因克隆、生物信息学及功能分析
运用克隆测序的方法，获得绵羊COIL基因CDS区全长1764bp，GUCY1A1基因CDS区全长2124bp，分别编码571、701个氨基酸。对COIL和GUCY1A1基因进行生物学信息分析，对其结构、理化性质和功能进行预测。推测COIL、GUCY1A1基因整个肽链亲水性和疏水性氨基酸分布较为均匀，但总体表现为较强的亲水性，均为亲水性蛋白，可促使蛋白聚合沉淀，且蛋白无跨膜区域，属于非跨膜蛋白，则促使其与受体结合从而进行生化活动。两个基因含有不同数量的潜在糖基化位点和磷酸化位点影响其蛋白翻译过程的运输和定位，从而更有利于繁殖机制的调节。
5、COIL基因在细胞中过表达及干扰研究
成功构建过表达载体pcDNA3.1-MHY-COIL，经双酶切和测序验证构建载体成功；设计干扰SiRNA序列，通过验证筛选出干扰效率最佳的序列。在小鼠卵巢纤维细胞和绵羊成纤维细胞中成功转染过表达载体和干扰序列，通过荧光定量和WB验证转染成功。通过细胞增殖和活性检测表明，COIL基因可以显著的提高小鼠卵巢纤维细胞和绵羊成纤维细胞中的增殖和活性，推测COIL基因在激活细胞增殖调控途径的同时，也提高了细胞的活性。将转染成功的绵羊成纤维细胞，通过荧光定量PCR来检测COIL基因对其互作蛋白的影响，结果显示当COIL过表达时，FBL、ATXN1、WRAP53、USPL1基因的表达活性极显著上升；当COIL基因干扰表达时，SMN7和Gemin2基因的表达活性极显著上升，说明与COIL基因呈现相反作用。
通过SLAF-seq技术，对产羔数不同的绵羊进行了全基因组关联分析，经过基因的分型和特异性表达实验证明，得出与产羔数相关的三个遗传标记，根据基因的功能预测和细胞实验，验证其多羔性状形成的机制，为揭示绵羊繁殖力的调控机制提供了新的线索。