电化学生物传感器是结合生物传感和电化学分析技术的新型分析模型,其具有灵敏度高、选择性好、成本低廉、稳定性强、能在复杂的体系中进行快速检测等特点,已被广泛应用在临床分析与疾病诊断等领域。目前,为了满足在临床分析与诊断过程中对目标物的痕量分析,多种信号放大技术被开发应用于放大电化学传感器的输出响应,提高传感器的性能。其中,酶因其自身具有专一性,高效性,反应条件温和等优点使得酶催化放大技术成为电化学信号放大技术中运用较成熟的技术之一。同时,酶级联反应是一种由前一步酶促反应产生后一步酶促反应底物的多酶协同反应,在这种情况下,能够降低中间体的无效扩散,提高酶级联反应的催化效率,因此,它也被越来越多的应用于生物传感领域的研究。基于此,本论文设计了多种高效率的酶级联催化放大体系,实现对多种肿瘤标志物的电化学灵敏检测。具体工作如下:1.基于DNA二聚体纳米器件操纵高效酶级联反应构建灵敏电化学生物传感器传统级联酶的固载一般会借助于纳米基质材料,例如碳纳米管,石墨烯,金属及其氧化物或者金属有机框架材料等。但是,在这种情况下,级联酶是随机,无序地吸附或者共价修饰到基质材料表面,限制了酶级联催化放大效率。为了解决这个问题,本工作中制备简单的DNA二聚体纳米器件来对级联酶葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)进行精确定位和组装,克服了传统支撑材料上关于级联酶无序排布的问题。在设计中,靶目标物microRNA-21诱导简单DNA二聚体纳米器件的组装,使得游离的GOx和HRP在目标物的驱动下固定在DNA二聚体纳米器件上。相比较游离的GOx/HRP催化体系,DNA二聚体纳米器件操纵的级联酶体系的催化效率有着明显的提高,通过监测酶级联电催化信号的变化,构建了灵敏检测目标物microRNA-21的电化学生物传感器,检测范围是0.1pmol/L~1 nmol/L,检测限达0.03 pmol/L。另外,这项工作中制备的简单的DNA二聚体纳米器件实现了在纳米级上排列级联酶,获得了高效率的酶级联催化放大来提高电化学传感器的性能,这也为传感分析和疾病诊断中其他生物分子的检测提供了一条新途径。2.基于DNA四面体作为支架精细调控酶级联催化效率用于电化学灵敏检测DNA在生命系统中,高效的酶级联反应还依赖于可靠的支架(如细胞骨架或细胞膜)对级联酶之间距离进行调控。为了模仿生物体内这种高效的催化机制,人们对人工支架的设计给予了极大的关注。一些传统的支架材料,例如MOF材料,金属纳米粒子或者DNA折纸等已被用来调节级联酶之间距离,以提高酶级联反应的催化效率。然而,它们不可避免地存在材料可控性和生物相容性差,或者制备复杂的缺点。本文利用DNA四面体结构的刚性和定向锚固性,将两种模型酶HRP和GOx分别锚定在四面体支架的顶点位置。通过改变DNA四面体的边长,精确调控了级联酶之间的距离,研究了酶间距离对酶级联催化效率的影响。在最优的酶级联催化作用下,构建了一种灵敏的电化学生物传感器用于基因p53片段的DNA检测,检测范围为0.01 pmol/L~10 nmol/L,检测限达3 fmol/L,为构建高效的酶级联放大系统提供了一种新思路。3.基于网状DNA四面体支架有序操纵级联酶的定位构建高效酶级联催化放大的电化学生物传感器一些传统的刚性的DNA纳米结构,包括DNA镊子,DNA折纸以及我们制备的DNA四面体已经作为可靠的支架用于精确地控制级联酶的排布和定位,构建了高效的酶级联反应系统。然而,这些DNA纳米支架操纵的级联酶系统也存在不可避免的缺陷:系统中任何两个支架之间的相互独立性使得单个支架只能同时操纵一对或两对级联酶,这不能保证所有级联酶的有序排列,酶级联反应的催化效率依然受限。在本工作中,我们将分别修饰有GOx和HRP的两种DNA四面体(TDN)支架单元在功能化的电极表面进行交替和等距的组装,在电极界面形成了网状DNA四面体纳米结构。在这种情况下,四面体支架上的所有级联酶呈现阵列排布,阵列中任意一个GOx产生的催化中间产物可以同时扩散向四个相邻的HRP酶表面,从而降低酶级联反应过程中中间产物的无效扩散。以此为概念,基于高效的酶级联放大体系我们构建了灵敏的电化学传感器,实现了对目标物凝血酶的灵敏分析,检测范围为1 pmol/L~10 nmol/L,检测限达到0.32 pmol/L,在生物合成、生物分析和生物诊断等领域有着广泛的应用前景。4.基于Fe-N掺杂的碳材料作为纳米酶构建新型酶级联催化放大的电化学生物传感器在前面的工作中,我们探究了提高两种天然酶之间的级联催化效率的方法。虽然天然酶具有高的催化活性,但大多数天然酶对热,酸,碱不稳定,结构易发生变化降低活性。同时,天然酶在生物体内的含量很低,难以提纯,生产成本高,因此会在实际应用方面受到一定的限制。为了解决这个问题,在本工作中制备了新颖的Fe-N掺杂的碳材料作为纳米酶构建高效酶级联催化放大的电化学传感器。Fe-N掺杂的碳材料具有好的辣根过氧化物酶的性质,通过结合DNA信号放大技术,目标物循环输出产物驱动电极界面上DNA步行器的行走,使得Fe-N掺杂的碳材料修饰在电极上,与电极界面原本固载的葡萄糖氧化酶构成了高效的酶级联催化系统。通过监测目标物诱导的级联电催化信号的改变,实现了对靶目标物凝血酶的高灵敏定量检测,检测范围是0.1 pmol/L~10 nmol/L,检测限为30 fmol/L。本工作设计的天然酶与模拟酶的级联反应综合了天然酶与模拟酶的优点,一定程度上促进了酶级联反应的应用,为高效酶级联放大体系的构建开辟了新思路。