论文部分内容阅读
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年人常见的一种神经退行性疾病,以进行性认知、学习和记忆功能障碍为主要临床表现。如今,老龄化进程日益加剧,AD发病率逐年上升。AD已成为仅次于心脑血管疾病和恶性肿瘤的重要致死性疾病。AD是一种多病因介导的疾病,其发病机制学说有很多,其中包括以Aβ毒性学说为核心的Tau蛋白异常学说、氧化应激学说、基因突变学说、金属离子代谢紊乱学说等,其中金属离子代谢紊乱学说是目前研究的一个重点。现代药理学对淫羊霍苷、黄芪甲苷、葛根素治疗AD的机制进行了大量的研究。上述研究发现淫羊霍苷、黄芪甲苷、葛根素对脑内神经递质含量、氧化应激水平、炎症反应等方面有影响,但对其改善脑铁超载的关注不足,目前这方面的相关研究也鲜见报道。Aβ是其前体蛋白APP经3种不同分泌酶进行分解代谢产生的,在α、β和γ位使APP发生裂解的蛋白酶分别称之为α、β和γ分泌酶。APP的异常剪切加工、Aβ形成及其从可溶状态到不溶状态的转变是AD发病机制中的关键环节。研究表明,细胞内APP有两种代谢通路:APP的非淀粉样代谢通路主要是α-分泌酶和γ-分泌酶共同剪切,第一步α-分泌酶首先剪切APP细胞外的位点产生具有神经保护作用的s APPα蛋白被释放到细胞外,另一部分留在细胞内的C83碎片,被γ-分泌酶剪切形成P3和AICD(APP intracellular domain),AICD留在细胞内,而P3是一种有毒物质被释放到细胞外,不产生Aβ;APP的淀粉样代谢通路主要是由β-分泌酶和γ-分泌酶共同剪切APP。先是BACE1位点被β-分泌酶剪切,产生s APPβ蛋白并被释放到细胞外,然后γ-分泌酶的剪切留在细胞内的C99产生Aβ多肽和AICD,此通路中产生Aβ;本课题组前期研究发现淫羊霍苷、黄芪甲苷、葛根素有效组分复方可以有效地减少Aβ的产生,并可以调节铁代谢紊乱。但其病理生理机制并不是十分清楚。本研究旨在通过对铁调素(hepcidin,HAMP)基因沉默的HT22细胞给予淫羊霍苷、黄芪甲苷、葛根素有效组分复方进行干预,探讨淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方是否通过影响APP水解中的关键蛋白,从而影响Aβ的形成。第一部分淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对APPswe/PS1d E9双转基因AD模型小鼠学习记忆和海马CA3区ADAM10表达的影响目的:探讨淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对APPswe/PS1d E9双转基因AD模型小鼠学习记忆和海马CA3区ADAM10表达的影响。方法:10月龄雄性APPswe/PS1d E9双转基因模型小鼠30只随机分为复方组、模型组和阳性药去铁斯诺(deferox,DFX)对照组,10月龄的雄性C57BL/6J小鼠10只作为正常对照组。以黄芪、淫羊藿、葛根有效组分复方给予复方组小鼠灌胃,黄芪甲苷、淫羊藿苷和葛根素的用量分别为80mg·kg-1、120mg·kg-1和80mg·kg-1。正常对照组和模型组小鼠以等量生理盐水灌胃,DFX组以DFX灌胃,剂量为100mg·kg-1,每日一次。用药结束后,采用Morris水迷宫检测各组小鼠学习记忆能力情况,并于水迷宫后取出小鼠的脑组织,应用免疫荧光、Real-time PCR和Western blot检测各组小鼠海马CA3区解聚素金属蛋白酶10(A disintegrin and metalloproteinase 10,ADAM10)的表达情况。结果:水迷宫实验结果显示,与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠的逃避潜伏期、游泳距离和游泳时间均明显延长(P<0.05),穿越平台区域次数、平台区域停留时间明显缩短(P<0.05),首次穿越平台的逃避潜伏期明显延长(P<0.05);与模型组小鼠相比,复方组和DFX组逃避潜伏期、游泳距离和游泳时间明显缩短(P<0.05),穿越平台区域次数、平台区域停留时间明显增多(P<0.05),首次穿越平台的逃避潜伏期明显减少;复方组和DFX组相比,逃避潜伏期、游泳距离、游泳时间、跨台次数、穿越平台区域次数、平台区域停留时间和首次穿越平台的逃避潜伏期均无显著差异(P>0.05)。免疫荧光、Real-time PCR和Western blot检测结果均显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠海马CA3区ADAM10的表达增高(P<0.05);与模型组相比,复方组和DFX组小鼠海马CA3区ADAM10的表达降低(P<0.05);复方组和DFX组相比,ADAM10表达水平无显著差异(P>0.05)。小结:淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方可缩短APPswe/PS1d E9双转基因AD模型小鼠的逃避潜伏期、游泳距离和游泳时间,增多穿越平台区域次数、平台区域停留时间,缩短首次穿越平台的逃避潜伏期,有效改善APPswe/PS1d E9双转基因AD小鼠的学习记忆能力,其机制可能与下调海马CA3区ADAM10 m RNA和蛋白表达有关。第二部分淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对APPswe/PS1d E9双转基因AD模型小鼠海马CA3区铁调素表达的影响目的:探讨淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对APPswe/PS1d E9双转基因AD模型小鼠海马CA3区铁调素表达的影响。方法:将30只10月龄的雄性APPswe/PS1d E9双转基因模型小鼠随机分为复方组,模型组和阳性药去铁斯诺(DFX)对照组,10只10月龄的雄性C57BL/6J小鼠作为正常对照组。用药结束后,取出小鼠的脑组织,应用免疫荧光、Real-time PCR和Western blot检测各组小鼠海马CA3区HAMP的表达情况。结果:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠海马CA3区HAMP的表达明显降低(P<0.05);淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方和DFX灌胃干预后,HAMP表达水平较模型小鼠明显升高(P<0.05)。复方组和DFX组相比,HAMP表达水平无显著差异(P>0.05)。小结:淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方可以上调APPswe/PS1d E9双转基因AD模型小鼠海马CA3区HAMP m RNA和蛋白的表达水平,这可能是其提高AD模型小鼠学习记忆的作用机制之一。第三部分淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方通过铁调素对HT22细胞APP水解关键酶的影响目的:探讨淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方通过HAMP对HT22细胞APP水解关键酶的影响方法:将HT22细胞分为:Control组、Aβ组(加入Aβ25-35处理24h)、RNAi组(转染HAMP-siRNA-3)、Aβ+RNAi组(加入Aβ25-35处理24h后转染HAMP-siRNA-3)、Aβ+TCM组(加入Aβ25-35处理24h后中药处理24h)、RNAi+TCM组(转染HAMP-siRNA-3 24h后中药处理24h)、Aβ+RNAi+TCM组(加入Aβ25-35处理24h后转染HAMP-siRNA-3 24h,然后中药处理24h)。应用免疫荧光、Real-time PCR和Western blot法检测ADAM10、解聚素金属蛋白酶17(A disintegrin and metalloproteinase 17,ADAM17)、β淀粉样前体蛋白裂解酶(Beta-site APP cleaving enzyme 1,BACE1)的表达情况。结果:与Control组比较,Aβ组(模型组)、RNAi组和Aβ+RNAi组中的BACE1在蛋白和m RNA水平表达均增高(P<0.05),ADAM10、ADAM17表达均降低(P<0.05);与Aβ组比较,Aβ+RNAi组中的BACE1在蛋白和m RNA水平表达均增高(P<0.05),ADAM10、ADAM17表达均降低(P<0.05),Aβ+TCM组中的BACE1在蛋白和m RNA水平表达均降低(P<0.05),ADAM10、ADAM17表达均增高(P<0.05);与RNAi组比较,Aβ+RNAi组中的BACE1在蛋白和m RNA水平表达均增高(P<0.05),ADAM10、ADAM17表达降低(P<0.05),RNAi+TCM组中的BACE1在蛋白和m RNA水平表达均降低(P<0.05),ADAM10、ADAM17表达均增高(P<0.05);与Aβ+RNAi组比较,Aβ+RNAi+TCM组中的BACE1在蛋白和m RNA水平表达均降低(P<0.05),ADAM10、ADAM17表达均增高(P<0.05);小结:淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方可以通过上调HAMP的表达,促进APP水解关键酶ADAM10和ADAM17的表达,抑制BACE1的表达,从而减少Aβ的生成。结论:淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方可以改善小鼠学习记忆能力,其机制主要通过其上调HAMP的表达,从而促进ADAM10和ADAM17的表达,抑制BACE1的表达实现的。