论文部分内容阅读
马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是马铃薯上重要害虫,也是我国重大检疫对象。阐明马铃薯甲虫调控变态的分子机理有利于新治理措施的开发。本文鉴定了马铃薯甲虫中bHLH家族成员和胰岛素/胰岛素样生长因子信号转导通路相关基因、囊泡型LdATPaseE和营养型氨基酸转运载体基因LdNAT1。采用RNAi技术干扰类胰岛素基因LdILP2、LdATPaseE和LdNAT1,分析了这些基因干扰后对马铃薯甲虫蜕皮的影响,阐明了这些基因影响蜕皮的分子机理。获得如下主要结果。1.营养信号通路的构建及功能验证分析鉴定了马铃薯甲虫49个bHLH家族成员,证明了基因组数据的完整性。发现了类胰岛素通路的58个基因,其中53个具有完整的ORF。绘制了马铃薯甲虫胰岛素/胰岛素样生长因子信号转导通路(Insulin/insulin-like growth factor signaling pathway,IIS)。测定了5个LdILP(LdILP1a、LdILP1b、LdILP1c、LdILP2和LdILP4)在不同发育期和不同组织的表达谱。采用RNAi技术沉默LdILP2的结果表明,取食dsLdILP2显著影响了马铃薯甲虫三龄幼虫的体重、化蛹和羽化。沉默LdILP2扰乱了IIS信号通路,其中28个相关基因表达量显著下降;8个基因表达量显著上升。此外,沉默LdILP2还抑制了保幼激素及蜕皮激素信号信号转导途径。以上结果验证了本章绘制的IIS信号转导通路的功能。2.RNA干扰LdATPaseE影响马铃薯甲虫蜕皮的分子机理克隆并验证了马铃薯甲虫LdATPaseE cDNA。在一龄、二龄和三龄的幼虫中,LdATPaseE在蜕皮后出现高峰,在龄末期出现低谷。在四龄幼虫中,LdATPaseE的最高峰出现在蜕皮后72 h,低谷出现在蜕皮后96 h。可见,在马铃薯甲虫L.decemlineata中20E滴度的高峰和LdATPaseE的表达水平的低谷同时出现。体内生测结果表明,20E和蜕皮酮类似物氯虫酰肼(Hal)在幼虫末龄抑制了LdATPaseE的表达量。相反,喂食LdSHD和LdFTZ-F1的dsRNA降低20E的水平则上调了LdATPaseE的表达量。因此,20E的峰值抑制了LdATPaseE的表达。进一步的实验表明,二龄幼虫喂食dsLdATPaseE-1和dsLdATPaseE-2,成功敲低了靶标基因,阻止二龄幼虫的生长,显著增加了二龄幼虫的死亡率。三龄和四龄幼虫喂食dsLdATPaseE-1和dsLdATPaseE-2,在极低浓度下即敲低了靶标基因,阻止了幼虫生长,显著降低马铃薯甲虫幼虫的化蛹率。此外,敲低LdATPaseE还显著升高了LdInR与Ld4EBP的表达量,抑制一个蜕皮激素合成基因的转录,降低20E滴度并降低了一个20E响应基因的表达。敲低LdATPaseE还抑制了一个JH合成酶基因的表达,降低了JH滴度,下调了一个JH早期响应基因的表达量。因此,敲低LdATPaseE通过抑制IIS信号途径,降低20E和JH的滴度、下调20E和JH信号而影响幼虫生长和发育。3.敲低营养型氨基酸转运载体基因LdNAT1影响IIS通路昆虫的中肠细胞通过SoLute Carrier family(SLC)营养型转运载体(Nutrient Amino acid Transporters,NAT)吸收必需氨基酸。本章克隆了马铃薯甲虫SLC6家族的LdNAT1。LdNAT1的mRNA水平在中肠的表达较高,在前肠、后肠和马氏管的的表达量中等,而在其它组织中的表达量较低。LdNAT1转录水平在蜕皮后迅速增加,而在蜕皮前降低,表明20E和JH的激素水平和LdNAT1的表达水平有关。体内生测表明20E和蜕皮激素类似物氯虫酰肼抑制了LdNAT1表达,而RNAi减少20E的合成基因LdSHD和20E信号途径基因LdFTZ-F1激活了LdNAT1的表达。相反,施用JH和JH的类似物吡丙醚或通过RNAi降低LdAS-C的表达从而增加JH的滴度上调了LdNAT1的表达,通过RNAi降低JH合成基因减少JH滴度则降低LdNAT1的表达。因此,LdNAT1响应20E和JH的信号。比较幼虫体内和粪便中的氨基酸含量,发现敲低LdNAT1影响了幼虫肠道对半胱氨酸、组氨酸、异亮氛酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸的吸收。此外,沉默LdNAT1抑制了胰岛素信号通路,影响了20E和JH滴度,扰乱了20E与JH的信号,从而影响幼虫生长和化蛹。因此LdNAT1在马铃薯甲虫中为一个SLC6家庭的营养型氨基酸转运载体。