抗猪支原体共同抗原单克隆抗体的制备与鉴定

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猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)168菌株F332经热灭活后以提纯的膜蛋白作为抗原,再与等量弗氏完全佐剂充分混合制成免疫原,腹腔注射免疫8周龄BALB/c小鼠,250μg/只;三周后,尾静脉注射相同剂量不加佐剂的抗原,三天后,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14进行融合。以间接ELISA和商接凝集试验反复筛选阳性克隆,并经有限稀释法三次亚克隆之后,共获得两株能稳定分泌特异单克降抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3-1G2和3-882。对单克隆抗体的特性鉴定结果表明,腹水单抗的间接ELISA效价分别为5×1013和5×1011;直接凝集效价分别为1:400和1:320。两株单抗的免疫球蛋白亚类均为IgG1,竞争ELISA试验测得两株单抗的亲和常数分别为40μg/mL和54μg/mL。在Dot-ELISA试验中两株单抗与Mhp和猪鼻支原体(M.hyorhinis,Mh)等反应,而不与鸡支原体、对照血清等反应。这些结果表明两株单抗可能是针对猪支原体共同抗原的单抗。 为了鉴定出单抗识别的这类共同抗原,首先以SDS-PAGE电泳分析猪支原体的膜蛋白成分,结果显示,Mhp168菌株F332、Mhp168菌株F99、Mhp国际标准株(J株)和Mh均有15~20条左右蛋白条带,其分子量在14~120Kd之间。高分子量的蛋白条带很淡,主要以中分子量和低分子量的为主,Mhp和Mh中均以80Kd和30Kd的蛋白条带最浓,Mhp168菌株F332在31~43Kd之间的蛋白条带比Mhp168菌株F99、Mhp国际标准株(J株)和Mh的多一些。其次以Western-blot分析,结果表明兔抗Mhp、Mh、猪絮状支原体(M.flocculare,Mf)和莱氏无胆甾原体(A.laidlawii,Al)高免血清与猪支原体的80Kd和30Kd蛋白条带反应,证实了猪支原体的共同抗原是80Kd和30Kd蛋白。进一步研究显示,单抗3-1G2和3-8B2均与Mhp和Mh的30Kd蛋白条带反应,而不与培养基中的猪血清反应,表明这两株单抗特异地针对Mhp、Mh、Mf和Al的共同抗原成分30Kd蛋白。可以看出,这两株单抗在Mhp的抗原分析、血清学诊断和疫苗质量监测以及细胞培养中支原体污染检测等方面有重要应用价值。
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