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戊型肝炎(Hepatitis E)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起的急性自限性疾病。其临床特征为发热、全身疲乏、食欲不振、厌油腻、恶心、呕吐、尿色深黄如浓茶、眼睛和皮肤发黄，肝功能检查出现转氨酶迅速升高到几百甚至几千单位，黄疸较常见，并可持续1周。在亚洲、非洲和美洲等发展中国家人群中发生比较普遍，在一些地区可占到急性病毒性肝炎的50％，是导致发病和病死的重要因素，尤其对孕妇可造成有20％的病死率。对人类健康具有严重危害性。HEV过去曾被认为是一种经肠道传播的非甲-非乙型肝炎病毒。Balagan等用免疫电镜技术从一名志愿受试者粪便中观察到直径为27～30nm的病毒样颗粒，从而证实该病毒为新型的非甲非乙型肝炎病毒，1989年东京国际会议正式将这一类型的肝炎及其相关病毒分别命名为戊型肝炎和戊型肝炎病毒。HEV基因组为单股正链RNA，约7.5kb，具有3个开放读码框(ORF)。病毒基因组的5′端到3′端依次为5′端非编码区(5′-NCR)、ORF1、ORF3、ORF2、3′-NCR及polyA尾。不同地区来源的HEV基因序列有一定的差异，但是同一地区来源的HEV的基因序列保持相对稳定。随着HEV不断被分离、克隆和鉴定，根据各毒株核苷酸和氨基酸的同源性的大小以及系统进化树的分析，全球的HEV至少有8个基因型。我国主要为Ⅰ和Ⅳ型，而且散发性戊型肝炎中以Ⅳ型为主。为了确定黑龙江省猪群中流行的HEV的基因型，以便更深入分析猪源HEV与人源HEV的关系，本研究采用RT-PCR方法对从猪粪便样品中分离的HEV大庆株(swOQ)的全基因组进行分片段扩增，并对其两个末端采用末端快速扩增法(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)进行扩增、克隆和测序。测序结果表明swDQ株去除3′端poly(A)尾全长为7234bp，5′-NCR为26bp，3′-NCR为69bp。5′和3′非编码区之间有3个ORF，ORF1从27到5144位核苷酸，全长5118bp，编码1705个氨基酸。ORF2从5141-7165位核苷酸，全长2025bp，编码674个氨基酸。ORF3从5169到5513位核苷酸，全长345bp，编码114个氨基酸，此序列已经登陆GenBank，序列号为DQ279091。通过生物学软件，将swDQ与已报道的4个基因型的29株HEV核苷酸和氨基酸序列比较发现，swDQ HEV全序列与HEVⅠ、Ⅱ、Ⅲ的同源性在74.7～79.1％之间，而与Ⅳ型HEV的同源性最高，其中ORF1区与Ⅳ型HEV核苷酸的同源性为81.9～83.5％，氨基酸同源性为93.5～94％，ORF2区与Ⅳ型HEV核苷酸的同源性为87.1～88.1％，氨基酸同源性为96.4～97.6％，ORF3区与Ⅳ型HEV核苷酸的同源性为94.4～96.5％，氨基酸同源性为90.3～96.5％。系统进化分析可以看出，核苷酸的进化与Ⅳ型HEV在一个分枝上，表明swDQ为Ⅳ型HEV。本研究首次报道了在中国黑龙江省猪体内分离到Ⅳ型HEV的全基因组序列。由于缺乏合适的体外培养系统影响HEV分子生物学特性的进一步研究，获得HEV的感染性分子克隆后，就可在DNA水平上通过突变、缺失、插入和互补等手段来研究HEV的基因复制和表达、RNA的自发重组和诱导重组、RNA病毒与宿主的相互作用(如病毒在细胞间的传递机制)等，也可进行抗病毒策略研究，还可用于构建新的病毒载体。在国内对猪HEV病毒的拯救尚属空白。本研究在已知猪HEV swDQ株全基因组序列的基础上，根据基因组和克隆载体的酶切位点，将猪HEV全基因组分为6个片段进行了RT-PCR扩增，将得到的片段经过一系列的克隆和亚克隆后，分别构建了含有基因组全长cDNA克隆的pHE和pCHE重组质粒。在pHE中，cDNA克隆的5′端上游引入了T7启动子序列，并选取一个克隆在3′端引入了分子标志NruI位点。进行全序列测序后，发现了7个核苷酸的缺失和一个核苷酸的插入，运用PCR突变修补了突变的碱基，最终获得了含有分子标志NruI的HEV swDQ株基因组全长cDNA的重组质粒pHEa。体外转录后，转染A549细胞和HepG2细胞，通过间接免疫荧光试验和RT-PCR初步检测为阳性。在pCHE中cDNA克隆的5′端上游引入了T7启动子序列、锤头状核酶；3′端引入了丁型肝炎病毒核酶，利用载体上的CMV、β-actin启动子，将含有HEV swDQ株基因组全长cDNA的pCHE转染A549细胞和HepG2细胞后，通过间接免疫荧光试验和RT-PCR初步检测为阳性。以上结果证明，含有HEV swDQ株基因组全长cDNA的pHEa和pCHE重组质粒是有感染性的。本研究首次在我国构建出了猪HEV感染性克隆。综上所述，本研究在充分普查黑龙江省猪群中戊型肝炎的流行及分布的基础上，对来源于猪粪便中的swDQ HEV进行了全基因组序列分析，确定该地区猪群中流行的HEV的基因型，以便更深入分析猪源HEV与人源HEV的关系。而且在获得全基因组序列的基础上构建了分别利用含有CMV、β-actin启动子和T7启动子的两个感染性克隆，获得有感染性的转录本，拯救出猪HEV，为HEV的分子生物学研究及基因工程疫苗研究打下基础，填补了国内空白。