【摘 要】
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将猪脂肪用胶原酶Ⅱ消化,离心后获得猪脂肪细胞。加入细胞膜萃取液,用超声波细胞粉碎机粉碎,离心后获得三酰甘油酯,经蔗糖密度梯度离心法提取猪脂肪细胞膜蛋白。用该脂肪细胞
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将猪脂肪用胶原酶Ⅱ消化,离心后获得猪脂肪细胞。加入细胞膜萃取液,用超声波细胞粉碎机粉碎,离心后获得三酰甘油酯,经蔗糖密度梯度离心法提取猪脂肪细胞膜蛋白。用该脂肪细胞膜蛋白作抗原,加弗氏佐剂后免疫BALB/c 小鼠,免疫剂量分别为100ug/鼠、100ug/鼠、50ug/鼠,经抗体效价测定,取明显高于阳性血清的免疫小鼠进行加强免疫,用其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 在融合剂聚乙二醇(PEG,MW4000)作用下融合,经有限稀释法克隆和亚克隆,建立了2 株能持续分泌抗猪脂肪细胞膜单克隆抗体的杂交瘤细胞株3B2 和3F3。对得到的杂交瘤细胞株经腹水效价测定、染色体数目分析、对热及酸、碱稳定性的测定、免疫球蛋白类别及亚类鉴定、特异性及亲和力的测定方法进行鉴定。结果表明:所获猪脂肪细胞膜蛋白抗原的浓度为4.97mg/ml,对该蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,得出:在116.0KD-66.2KD 之间存在两个条带,在66.2KD-45.0KD 之间存在两个条带,在14.4KD 以下存在一个条带,其中存在64KD 的猪特异性脂肪细胞膜蛋白;对免疫小鼠抗体效价进行测定,其中有三只小鼠抗体效价明显高于阳性血清;通过猪脂肪细胞膜蛋白单克隆抗体的制备,得到2 株能持续分泌抗猪脂肪细胞膜单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3B2 和3F3;对所获单抗用ELISA 法测其腹水效价,为1:105,鉴定其亚类类型为IgG1 和IgG2b,染色体数目为80~100 条,竞争抑制率在50%以上,ELISA 法测定它与猪脂肪细胞膜蛋白抗原的亲和常数为4.63×109,并且所分泌的单抗对热、酸、碱等环境因素基本保持稳定。
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