论文部分内容阅读
康普瑞汀磷酸二钠（Combretastatin A4 disodium phosphate,CA4P）属于肿瘤血管靶向类药物,通过与微管蛋白结合而发挥抗肿瘤血管效应,经多项临床试验显示,高剂量CA4P可引发严重的QT间期延长,增加尖端扭转型室性心动过速（torsades de pointes,Tdp）或心源性猝死（sudden cardiac death,SCD）的发生风险。心电图上的QT间期在心室肌细胞动作电位时程（action potential duration,APD）中代表心室去极化和复极化的持续时间,QT间期延长表示心室复极的延迟,快速型延迟整流钾电流（the rapid component of Ik,IKr）是APD复极期的主要通道电流,对此通道的抑制是药物延长APD,诱发QT间期延长主要机制。由human ether-a-go-go相关基因编码的K+离子通道（hERG基因）建立的外源性表达系统可有效记录IKr电流,经研究证实体外IKr/HERG通道检测是判断药物能否延长心室复极的重要指标。本课题基于研究CA4P对豚鼠心室肌细胞APD的作用,以及CA4P对IKr/HERG通道的影响,探索CA4P引起QT间期延长的电生理机制,并评估CA4P引起Tdp的风险程度。第一部分康普瑞汀磷酸二钠对动作电位时程的抑制作用研究目的评价CA4P对豚鼠心室肌细胞APD的影响。研究方法利用全细胞膜片钳技术记录系统,以急性分离的豚鼠心室肌细胞为材料,观察不同浓度10μ mol.L-1和100μ mol.L-1CA4P对动作电位50%复极时程（APD at 50%of repolarization,APD50）、动作电位 90%复极时程（APD at 90%of repolarization,APD90）、豚鼠心室肌细胞静息膜电位（resting membrane potential,RMP）、动作电位幅度（action potential amplitude,APA）、0期最大去极化速率（maxium rate of depolarization,Vmax）的影响。研究结果10μmol.L-1和100μ mol.L-1CA4P均可显著延长心室肌细胞APD50和APD90,且高浓度CA4P对APD的延长作用明显高于低浓度CA4P,APD50延长率分别为15.77%和42.01%,APD90延长率分别为10.15%和31.36%（P<0.05）。在停止给药后使用细胞外液继续对同一个细胞进行灌流,用以观察药物的作用能否去除,结果表明,经洗脱后心室肌细胞动作电位时程有所回落,但不能恢复到给药前的最初状态,表明CA4P延长动作电位时程具有浓度依赖性,可以部分洗脱。10μ mol.L-1 和 100μ mol.L-1CA4P对 RMP、APA、Vmax 均无影响。研究结论CA4P可延长豚鼠心室肌细胞APD,且具有浓度依赖性。第二部分康普瑞汀磷酸二钠对hERG电流的抑制作用研究目的研究CA4P对人类ether-a-go-go相关基因（hERG基因）编码的K+离子通道的影响。研究方法建立全细胞膜片钳技术记录系统,使用稳定转染并表达人源心肌hERG离子通道的HEK-293细胞,以特非那定作为阳性对照品,给予3μmol.L-1、10μ mol.L-1、30μmol.L-1、100μmol.L-1 和 300μmol.L-1CA4P,观察药物对 hERG 通道尾电流的剂量依赖性;在 30μmol·L-1CA4P 下,分别给予 10mV,20mV,30mV,40mV 和 50mV电压刺激,观察药物对hERG通道尾电流的电压依赖性;在药物浓度为300μ mol·L-1下,观察CA4P对hERG电流的时间依赖性;计算半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）,根据IC50和最高血浆药物浓度（Cmax）计算安全边缘系数,hERG安全边缘系数计算公式=IC50/Cmax,其结果<30倍为阳性结果,评估药物导致尖端扭转性室速（Tdp）的风险。研究结果CA4P可浓度依赖性抑制hERG尾电流幅度,给予3μmol·L-1、10μmol·L-1、30μmol·L-1、100μmol·L-1和 300μmol·L-1CA4P后hERG通道尾电流的抑制率分别为（9.8±4.8）%,（19.2±5.0）%,（44.3±2.5）%,（77.2±2.9）%和 100%,结果表明,伴随药物剂量的增大使hERG尾电流幅度明显降低。CA4P可抑制 hERG 尾电流幅度,30mol·L-1CA4P 在电压 10mV,20mV,30mV,40mV和50mV时对hERG电流的抑制率分别为（9.9±8.5）%,（23.7±9.1）%,（27.3±7.5）%,（32.3±9.4）%和（31.8±10.5）%,可见在正电位时 CA4P 对 hERG电流的抑制作用随着电压增高,表现出抑制率逐渐增强趋势。300μmol·L-1CA4P阻断hERG电流随时间延长尾电流幅度迅速下降,在2 min时出现明显降幅,在给药8 min后hERG通道尾电流可全部被抑制,说明CA4P对hERG通道尾电流的影响具有,洗脱后可部分恢复。IC50为54.9μmol·L-1,计算安全边缘系数为2.8（<30倍）,即表明当CA4P使用剂量达到人体最低治疗剂量以上时则具有较高的药物hERG易感性。研究结论CA4P具有抑制hERG通道电流的作用,呈浓度依赖性、电压依赖性、时间依赖性。CA4P对hERG通道的抑制是其延长APD的作用机制,此结果与对豚鼠心室肌细胞APD的作用一致。根据安全边缘系数计算具有导致尖端扭转性室速（Tdp）的高风险,提示在高剂量用药或同服其他易致QTc间期延长的药物时应引起注意。