【摘 要】
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通过微生物代谢工程和合成生物学技术能够开发微生物细胞工厂去生产各种有价值的目标产物,比如生物基化学品和生物燃料等。由于代谢调控也是微生物代谢工程研究领域的方向之一,对于提高目标产物的产量具有重要的推动作用,越来越成为各国科学家的研究热点。本论文以大肠杆菌为研究对象,在构建代谢调控的策略方面开展了以下两方面的工作,分别是从构建起始密码子库和给予电能的角度对大肠杆菌进行了代谢调控方面的研究,主要研究内
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通过微生物代谢工程和合成生物学技术能够开发微生物细胞工厂去生产各种有价值的目标产物,比如生物基化学品和生物燃料等。由于代谢调控也是微生物代谢工程研究领域的方向之一,对于提高目标产物的产量具有重要的推动作用,越来越成为各国科学家的研究热点。本论文以大肠杆菌为研究对象,在构建代谢调控的策略方面开展了以下两方面的工作,分别是从构建起始密码子库和给予电能的角度对大肠杆菌进行了代谢调控方面的研究,主要研究内容由以下两个部分组成:第一部分以大肠杆菌为研究对象,以报告蛋白表达量和玉米黄素产量为评价指标,研究了基于起始密码子的组合调控策略对代谢通路的调控效果。传统的代谢调控策略有启动子或者RBSs调控,但是这类调控的弊端是包含较长的序列和操作复杂。本部分的研究发现仅仅通过改变基因编码框（CDS）起始密码子的三个碱基,结果表明报告蛋白（RFP,GFP和lac Z）的表达库p NNNrfp,p NNNgfp和p NNNlac Z具有较大的动态调控范围和均匀的表达水平,然后设计了基于起始密码子的组合调控策略并将其应用到调控玉米黄素生物合成途径中的三个基因（crt Z,crt Y和crt I）,以较短的实验时间,获得了一个包含各种各样的玉米黄素产量的组合调控库,其中筛选到了玉米黄素产量为6.33 mg/L和胞内含量为1.24mg/g DCW的高产菌株,与对照菌株相比均有了约10倍的提高,表明了应用基于起始密码子的组合调控策略来优化代谢通路确实是可行的,也为大肠杆菌基因的代谢调控提供了一种新的省时省力的方法和策略。第二部分以大肠杆菌为研究对象,利用微生物电合成平台系统,构建电能细胞,以丁二酸产量为评价指标,研究了给予电能对细胞代谢的影响效果。电化学能源对于生物合成各种化合物是一个重要的因素,以前的研究中多数是以天然的电活性菌株来实现电合成各种化合物,在本研究中,分别构建了两种不同的大肠杆菌电能细胞,具体如下:首先,引入来源于希瓦氏菌MR-1中的与电子传递相关的mtr ABC,fcc A和cym A基因,成功构建了电活性菌株E.coli 8739（p Mtr ABC,p Fcc A-Cym A）并能够利用电能实现增加还原性产物产率的目标,其中电合成产物乳酸的得率从0.10增加至0.22 mol/mol葡萄糖,乙醇从0.63增加到0.96 mol/mol葡萄糖,分别是不通电条件下的2.2倍和1.5倍。随后,构建了电活性菌株E.coli T110（p Mtr ABC,p Fcc A-Cym A）来电合成丁二酸,并且引入碳浓缩机制（CCM）增强利用CO2的能力,最终电活性菌株E.coli T110（p Mtr ABC,p Fcc A-Cym A,p BTCA）能够利用电能提高丁二酸的转化率,在通电的环境中,丁二酸转化率达到了1.10 mol/mol葡萄糖,比出发菌株E.coli T110提高了61.8%。其次,通过提高大肠杆菌细胞内部的FAD含量,构建了基于辅因子FAD的电活性大肠杆菌菌株,工程菌株E.coli 8739（p Rib AB-Ybj I-Yig B,p Rib ECF）在MES系统中发酵代谢图谱会改变,会生成更多的还原型化合物,其中电合成产物乳酸的得率从0.51增加至0.90 mol/mol葡萄糖,乙醇从0.37增加到0.59 mol/mol葡萄糖,分别是不通电条件下的1.8倍和1.6倍。在MES系统中通电的条件下,电活性菌株E.coli T110（p Rib AB-ybj I-Yig B,p Rib ECF）的丁二酸转化率为0.97 mol/mol葡萄糖,比对照菌株E.coli T110提高了42.65%,引入碳浓缩机制（CCM）后,工程菌株E.coli T110（p Rib AB-Ybj I-Yig B,p Rib ECF,p BTCA）的丁二酸转化率为1.16mol/mol葡萄糖,比对照菌株E.coli T110提高了70.59%。本部分的研究成功的搭建了微生物电合成平台,并实现了利用电能来提高目标化合物丁二酸转化率的目标,表明了利用电能来调控大肠杆菌的代谢从而实现目标产物提高的策略是可行和有效的。本论文研究表明起始密码子优化和电能的利用都可增加大肠杆菌代谢产率,在理论和实践上对代谢产率和模式推动等方面提供了新的研究策略和手段。
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