性别是自然界有性生殖生物所具有的基本特征,雌雄个体在生理、形态及行为方面存在巨大差异。家蚕是鳞翅目昆虫,因其可以分泌蚕丝而成为重要的经济昆虫。家蚕雌雄个体之间存在巨大差异,因雌性个体需要使用大量能量来产生后代而导致雄性个体产丝效率更高,经济效益也更高。另一方面,家蚕作为鳞翅目模式昆虫,对它的性别决定研究也能给我们防治鳞翅目害虫提供新思路。BmSxl是果蝇Sxl的同源基因,在家蚕中已报道的有两种选择性剪接形式BmSxl-L以及BmSxl-S。有研究报道BmSxl对雄性精子二态性发育有调控作用。我们课题组克隆得到了另外两种选择性剪接形式BmSxl-PA和BmSxl-PB,其中BmSxlPB为精巢特异表达的剪接体形式。在我们已有的研究中发现BmSXL是一种RNA结合蛋白,能够结合到自身的poly（U）序列实现自我的剪接调控。并且发现BmSXL蛋白能够结合到nanos m RNA的3’端UTR区域的poly（U）序列上调控nanos的表达。在本论文中,我们通过RNAi下调表达BmSxl以及转基因上调表达BmSxl来进一步研究BmSxl在家蚕生殖细胞发育中发挥的功能。同时通过凝胶阻滞、免疫荧光、荧光定量PCR和细胞流式分析等方法分析BmSxl作用和调控的方式。获得了以下研究结果:1.BmSxl的表达分析我们首先通过荧光定量PCR和RT-PCR以及Western Blot分析了BmSxl在家蚕各组织及时期的表达模式。结果表明BmSxl在家蚕性腺高量表达,在雄性精巢中表达量最高。并且BmSxl-PB剪接形式在精巢中表达而在卵巢中不表达。在家蚕精卵巢中,BmSxl从五龄七天开始表达升高,在精巢中升高的程度要远大于在卵巢中升高的程度。随后我们将精巢外膜与内容物分开分析BmSxl的表达情况,结果显示BmSxl-PB主要在精巢内容物中表达,而BmSxl-PA剪接形式主要在外膜中表达。因此我们推测BmSxl在家蚕生殖细胞发育中可能发挥功能。2.BmSxl的RNA干涉及干涉后家蚕生殖器官表型为了进一步研究BmSxl在家蚕生殖细胞发育中发挥的功能,我们使用BmSxlPA和BmSxl-PB共同区域设计了干涉双链RNA引物,然后合成BmSxl的双链RNA进行干涉实验。实验结果显示在下调表达BmSxl的雌性个体中,内生殖器卵巢输卵管末端未见未成熟卵子,卵子发育不连续;雄性外生殖器出现排泄口膨大的现象。这些结果暗示着BmSxl在雌雄中发挥着不同的生理功能,BmSxl表达水平的降低会影响雌性个体卵子的发育以及雄性个体外生殖器的正常发育。3.BmSxl转基因家蚕品系的建立及其生殖器官表型接下来我们使用转基因方法在个体上增量表达BmSxl。首先使用家蚕c DNA模板克隆得到了精巢特异表达的BmSxl-PB形式,然后将其与转基因基础载体连接,获得了piggy Bac[3×P3-Red-SV40,A4-BmSxl-PB-SV40]重组载体,最后通过显微注射的方式将转基因载体注射到蚕卵中,筛选获得阳性个体后进行转基因插入位点鉴定和目的基因表达量检测进一步确认获得BmSxl转基因家蚕。转基因家蚕生殖器表型显示雌性个体外生殖器的诱惑腺变得不规则,内生殖器卵巢输卵管末端未见未成熟卵子,卵子发育不连续;免疫组化冷冻切片结果显示雄性个体的内生殖器精巢外膜变厚。这些结果说明BmSxl-PB对家蚕外生殖器官发育以及卵子发生发挥着重要作用。综合转基因过量表达和RNA干涉实验结果,BmSxl在家蚕生殖器官发育和生殖细胞调控中发挥着重要作用。4.BmSxl对细胞周期的调控文献报道家蚕的生殖细胞发育过程受到细胞周期的调控。因此我们分析了在BmSxl表达水平改变后细胞周期蛋白基因cyclin A,cyclin D和CDK的表达量变化。结果显示在BmSxl表达水平改变时,细胞周期相关基因的表达水平也会改变,并且在雌雄个体中变化趋势不一致。这些结果暗示BmSxl能够调控细胞周期相关基因的表达,而且在雌雄中发挥着不同的调控作用。进一步,我们在BmN细胞中分别上调表达BmSxl和下调表达BmSxl后收集细胞PI染色后进行细胞周期流式分析。流式分析结果显示BmSxl表达水平改变后,不同时期的细胞比例均发生了变化,即细胞的分裂周期发生了变化。结果说明BmSxl对家蚕细胞的分裂周期具有调控作用。我们进行了免疫荧光染色实验观察细胞分裂形态变化情况。实验结果显示上调表达BmSxl-PA的细胞有丝分裂后期时细胞核不均等分裂;下调表达BmSxl的细胞染色体在细胞核不能整齐排列在赤道板上。这些结果显示BmSxl影响细胞分裂时的染色体行为以及细胞核的分裂。5.BmSxl对减数分裂相关基因的影响先前文献报道Aly基因在减数分裂中发挥着调控作用。因此我们检测了BmSxl表达改变厚Aly基因的表达情况。结果显示在BmSxl的表达水平改变后,Aly的表达水平也相应发生了变化,且是同向变化。结果说明BmSxl能够正调控减数分裂相关调控基因Aly的表达。6.BmSxl对性别决定下游关键基因Bmdsx的影响Bmdsx是家蚕性别决定途径下游的关键基因。我们分析发现在Bmdsx的第三内含子上有一段poly（U）序列,我们推测BmSXL蛋白能够结合到这段poly（U）序列上,因此我们将这段序列合成探针进行凝胶阻滞（EMSA）结合实验。结果显示BmSXL蛋白能特异性地与这段poly（U）序列结合。进一步,我们分析了Bmdsx雌雄剪接形式在BmSxl表达水平改变后的变化。结果显示在BmSxl表达水平改变后,Bmdsx的雌雄剪接形式的表达量也发生了变化,但是我们没有直接检测到Bmdsx的选择性剪接发生了变化。这些结果说明BmSxl对Bmdsx的选择性剪接有一定的影响,但是其影响或许不是不可或缺的。综上所述,BmSxl在家蚕生殖细胞调控中发挥着重要功能,并且其可能通过影响细胞周期、减数分裂和/或Bmdsx基因表达等来发挥在生殖细胞中的作用。我们的结果为深入理解家蚕性别决定和分化提供了新的数据。