【研究背景及目的】原发性肝细胞癌(简称肝癌)是目前最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在所有恶性肿瘤中位居全球第六位,病死率高达全球第三位。肝癌的发生发展受多种肿瘤相关基因的调控,包括癌基因的激活及抑癌基因的失活,但确切机制仍不清楚。因此寻找肝癌早期发生发展过程中的分子标志物以及深入研究肝癌进展转移过程中重要分子机制显得尤为重要。神经上皮细胞转化基因1(Neuroepithelial cell transforming 1,NET1)是鸟苷酸交换因子家族的重要一员,而鸟苷酸交换因子具有激活和调节Rho家族蛋白的功能。当NET1定位到细胞质时便会活化Rho GTP酶,进而发挥调控细胞骨架重组和促肿瘤发生的作用。NET1作为促癌基因已被报道参与多种癌症的发生发展,包括胃癌、乳腺癌、神经胶质瘤、食管癌和膀胱癌。本研究旨在探究以下问题:(1)检测NET1在肝癌样本中的表达水平以及与肝癌患者临床病理特征及预后的关系。(2)探究NET1在体内外对肝癌细胞系生物功能的影响。(3)NET1发挥生物功能的分子机制。【研究方法】首先,在肝癌临床样本中明确NET1在m RNA和蛋白水平的表达情况。另外在肝癌患者组织芯片中,采用免疫组化方法明确NET1在肝癌及癌旁组织的表达水平。Kaplan-Meier方法分析NET1的表达与肝癌患者预后的关系,通过χ~2检验分析NET1与肝癌患者临床病理特征之间的关系。在生物学功能方面,首先构建NET1过表达和敲低的稳转肝癌细胞系,采用MTT实验、结晶紫及transwell实验探索NET1对于肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;接着利用裸鼠皮下成瘤模型、裸鼠肝内转移和肺转移模型进一步探究NET1对于肝癌细胞体内生长和转移能力的影响。在机制方面,首先利用转录组测序分析和生物信息学分析对敲低NET1和对照的YY-8103细胞系进行测序分析,筛选差异化表达基因,富集具有调控NET1生物学功能的的潜在关键信号通路。然后,利用Western Blot技术和Real-time PCR分析验证NET1可能的作用通路。【研究结果】1.根据临床组织样本和组织芯片的分析结果发现,NET1在肝癌组织中的表达升高。Kaplan-Meier生存分析发现,NET1高表达的患者无论是OS还是DFS均明显较差。NET1的表达与AFP、肿瘤大小、微转移灶、门静脉癌栓和微血管侵犯等临床病理特征密切相关。2.根据表达水平差异,选择Hep3B和Huh7两个低表达NET1的细胞系构建过表达NET1的稳转细胞系,同时高表达NET1的CSQT-2和YY-8103被用于构建低表达NET1的细胞系。3.MTT实验和结晶紫实验发现,过表达NET1可促进肝癌细胞系体外的增殖能力,反之敲低NET1后增殖能力被抑制。transwell实验发现,过表达NET1可促进肝癌细胞系体外的迁移和侵袭能力,反之敲低NET1后迁移和侵袭的能力被抑制。4.裸鼠皮下成瘤模型、裸鼠肝内转移和肺转移模型实验发现,过表达NET1可促进肝癌细胞系体内生长和转移的能力,反之敲低NET1后生长和转移的能力被抑制。5.转录组测序GSEA富集分析发现在敲低NET1后,与AKT通路相关的基因集表达普遍降低,提示敲低NET1后或可对AKT信号通路产生重要的影响。6.Western Blot检测结果发现,过表达NET1可以增加p-AKT的表达;反之,敲低NET1可以降低p-AKT的表达。同时,AKT的抑制剂(MK2206)可以恢复NET1的促增殖、迁移和侵袭作用。7.对EMT通路相关基因E-cadherin、N-cadherin、Snail、Twist和ZEB的Western Blot检测结果发现,NET1可以通过上调Snail的表达而促进肝癌细胞的EMT过程。8.NET1的表达可以预测索拉菲尼治疗的敏感性,索拉菲尼对低表达NET1肝癌患者的治疗效果更好。【研究结论】NET1在肝癌组织中高表达,且高表达NET1的患者预后差。细胞和动物实验证明过表达NET1可以显著促进肝癌细胞在体内外的生长和转移能力,发挥着重要的促癌作用。在机制方面,我们确定了NET1可以通过激活AKT的磷酸化和上调Snail的表达来发挥作用。但更具体的机制还需进一步探索。本研究证明NET1可以作为一个新的潜在的治疗靶点。