研究背景:以影像引导的肿瘤热消融为代表的局部介入治疗已成为肿瘤患者非手术治疗的重要组成部分。特别是微波消融（MWA）以其加热效率高、消融面积大、组织穿透深、“热沉效应”低等特点脱颖而出,并逐渐成为肿瘤热消融的主流选择。但其仍然存在热扩散快、缺乏组织特异性、单一疗效差、肿瘤复发率高等问题。纳米医学的快速发展为解决肿瘤MWA面临的困境提供了新的思路。本论文旨在通过纳米材料的设计和合成,构建体系简单、靶向性强、毒副作用小同时具有优异微波加热性能和多重抗肿瘤能力的新型纳米微波增敏剂,并在多种肿瘤模型中探究其增敏效果及作用机制,以期为提高肿瘤MWA疗效同时降低对正常组织的热损伤提供新的策略。第一章:经动脉灌注靶向递送Bi2Se3纳米花增强兔原位肝癌的微波消融疗效目的:本研究旨在制备新型非离子负载型花状微波增敏剂,并将微创介入技术与纳米材料深度融合,以期在兔VX2原位肝肿瘤模型中实现低功率下微波热疗增敏治疗和正常组织的微波防护效应。方法:1、合成与表征:以天然氨基酸L-硒代胱氨酸和Bi（NO3）3·5H2O分别作为硒源和铋源,在可见光照下通过调控反应参数设计合成具有多层花瓣状结构的Bi2Se3纳米花（Bi2Se3 NFs）。利用扫描电镜、透射电镜、能量色散光谱仪、X射线粉末衍射仪、X射线光电子能谱仪以及傅里叶变换红外光谱仪对所制备纳米材料的形貌尺寸、晶体结构、元素组成以及表面修饰进行表征。2、体外微波加热性能的评估:通过红外热像仪实时监测微波辐照下（2450 MHz,5.0 W）不同浓度纳米材料溶液(0、0.5、1.0、2.0 mg m L-1)的温度变化并在离体组织进行微波热增敏性能的验证。每组设置三个重复。3、模型构建及分组治疗:通过超声引导套管针植入的方法构建兔VX2原位肝肿瘤模型,将荷瘤兔随机分为四组（n=3）:对照组;Bi2Se3NFs组;MWA组;Bi2Se3 NFs+MWA组。在数字减影血管造影机的引导下通过临床可用的经动脉灌注（TAI）介入手术将Bi2Se3 NFs精准、靶向递送到肝肿瘤部位。介入给药24小时后开腹行MWA手术,同时,通过红外热像仪监控MWA的全过程。4、疗效监测及机制研究:利用CT成像动态监测各组肝肿瘤的体积变化并计算肿瘤倍增时间。观察结束后,取肿瘤组织以及重要脏器经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片后通过H＆E染色和免疫组化染色评估各组凝固坏死、细胞凋亡和热休克蛋白70的表达水平。5、生物安全性评估:CCK-8、溶血实验、血常规、血生化以及重要脏器组织H＆E染色被用于评估纳米材料的生物安全性。结果:1、在温和条件下通过简单的一步法制备了尺寸约为891.17±106.23 nm的Bi2Se3 NFs。2、与去离子水相比,所制备的Bi2Se3 NFs(2.0 mg m L-1)在微波辐照下显示出明显的热增敏属性（38.0±2.6℃vs 54.2±1.6℃,P＜0.05）,且随着材料浓度、微波辐照时间以及微波输出功率的增加而增加。类似地,注射Bi2Se3NFs水溶液的猪肉组织的局部坏死直径和坏死体积均明显大于单纯去离子水组（P＜0.05）。然而,在相同的微波辐照下,呈片状结构的Bi2Se3纳米盘水溶液与去离子水组之间的温度变化未见显著差异（P＞0.05）。3、活体红外热像图结果显示:在兔VX2原位肝肿瘤模型中,Bi2Se3 NFs+MWA组的肿瘤中心温度（86.7℃）明显高于单独MWA组（51.6℃）。术后CT随访结果表明,与单独接受MWA的肿瘤相比,同时接受Bi2Se3 NFs和MWA的肝肿瘤生长受到显著抑制,且肿瘤倍增时间延长了2.2倍（P＜0.01）。术后组织病理学检查结果显示,与MWA组相比,Bi2Se3 NFs+MWA联合处理组表现出更严重的核固缩、核溶解以及胞质嗜酸性变,且Tunel以及HSP70的表达水平均进一步增强。4、Bi2Se3 NFs的CT密度值随着纳米材料浓度的增加而增加。在相同浓度下,Bi2Se3 NFs的CT值明显高于商业化对比剂碘佛醇。5、实验期间不同处理组的血液学指标以及重要器官的H＆E染色结果未见明显变化。结论:Bi2Se3 NFs具有独特的微波增敏特性以及CT辅助成像性能,结合TAI介入技术,在较低功率下实现对兔VX2原位肝癌的微波增敏治疗并同步降低微波热对正常组织的损伤。第二章:基于NaxWO3纳米晶体的微波消融和化学动力学联合治疗三阴性乳腺癌目的:本研究旨在探讨六方相NaxWO3纳米晶的微波热敏特性和类芬顿催化性能,进一步研究基于该纳米晶体的微波消融和肿瘤微环境响应性化学动力学对小鼠4T1三阴性乳腺癌移植瘤的联合治疗作用。方法:1、合成与表征:采用环保水热法,以WO3前驱体和Na2SO4为原料,在还原剂乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）存在下合成六方相NaxWO3纳米晶体。热重分析仪对样品的表面修饰进行定量分析。Zeta电位及粒度分析仪对所制备样品的表面电荷以及水合动力学尺寸进行分析。其余的材料表征方法同第一章节。2、体外微波加热性能的评估:同第一章节。3、体外氧化还原性能的评估:利用活性氧探针（DCFH-DA）和对苯二甲酸钠（TA）检测NaxWO3纳米晶体的类芬顿反应性能。利用Ellman实验评估氧化态NaxWO3纳米晶体的体内外谷胱甘肽消耗特性。细胞层次选择小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞和人脐静脉血内皮细胞（HUVEC）分别作为肿瘤细胞和正常细胞,采用CCK-8、克隆形成实验和线粒体膜电位JC-1检测NaxWO3纳米晶体选择性杀伤肿瘤细胞的可行性和机制。为了验证H2O2对·OH生成的贡献,在HUVEC细胞中加入终浓度为100μM的外源性H2O2以模拟H2O2过表达的局部微环境。4、活体层次联合治疗效果的评估:雌性BALB/c正常小鼠右后肢皮下接种4T1乳腺癌细胞,待肿瘤体积达到50 mm~3左右时进行随机分组（n=5）:对照组;NaxWO3纳米晶体组;MWA组;NaxWO3纳米晶体+MWA组。瘤内注射50μL灭菌水或者NaxWO3纳米晶体后行微波消融术（2450 MHz,5.0 W）。治疗结束后,正常饲养小鼠,并且每隔一天监测各组小鼠的体重和肿瘤体积。观察结束后,取小鼠肿瘤及重要脏器行组织病理学H＆E染色以及细胞凋亡标志物Tunel的免疫组化分析。5、生物安全性评估:同第一章节。结果:1、通过环保水热法成功制备了PVP修饰的长度约为100-150 nm,直径约为5 nm的六方相NaxWO3纳米晶体。热重分析结果表明该纳米晶体表面修饰的PVP含量约为7.86%。在生理溶液中保存7天后,该纳米晶体的水合动力学尺寸未见明显变化。2、在微波作用下,浓度为30 mg m L-1的NaxWO3晶体溶液在6分钟内升温幅度可达53.3±1.85℃,而去离子水组的温度仅上升39.0±1.11℃（P＜0.001）。3、X射线光电子能谱结果显示NaxWO3纳米晶体中钨元素呈现灵活可变的氧化还原价态(W5+/W6+)。体外模拟液的DCF荧光光谱图和TAOH荧光光谱图显示,以W5+为优势价态的NaxWO3纳米晶体具有类芬顿反应性能,可分解H2O2生成强氧化性的·OH,且该催化性能随着底物浓度、反应时间以及反应温度的增加而逐渐增强。Ellman实验结果显示,氧化态NaxWO3纳米晶体处理的4T1肿瘤细胞中GSH与GSSG的比值较对照组下降了57.6%（P＜0.05）。CCK-8实验表明当NaxWO3纳米晶体浓度达到400μg m L-1时,4T1细胞的活力下降到67.8±2.6%,而HUVEC细胞活力仍接近100%。当加入外源性H2O2和NaxWO3纳米晶体后,HUVEC细胞活力明显下降（77.2±5.7%）。克隆形成实验的结果与CCK-8实验结果相一致。JC-1实验结果进一步揭示NaxWO3纳米晶体处理的4T1细胞线粒体膜电位发生去极化改变,而HUVEC细胞的线粒体膜电位并无明显的改变。上述结果均表明NaxWO3纳米晶体可以通过·OH诱导的线粒体功能障碍选择性地抑制肿瘤细胞的生长,而对正常细胞的损伤较小。4、与对照组相比,NaxWO3纳米晶体组的小鼠肿瘤体积略有减少（P＜0.05）,单独MWA组小鼠的肿瘤生长明显受到抑制,而NaxWO3纳米晶体+MWA处理组呈现最好的肿瘤体积抑制效果以及最严重的肿瘤坏死和凋亡。5、实验期间小鼠体重、血液学指标以及主要器官组织学分析均未见明显变化。结论:六方相NaxWO3纳米晶体具有优异的类芬顿反应性能,通过在肿瘤部位同时产生加热效应和强氧化性的·OH实现了外源性MWA和内源性化学动力学联合治疗小鼠4T1三阴性乳腺癌移植瘤。第三章:基于纳米碳联合热疗与化疗协同抑制乳腺癌细胞增殖及淋巴转移目的:本研究旨在以临床批准的淋巴示踪剂碳纳米混悬注射液（CNSI）为载体,制备集热增敏、化疗及光声成像于一体的新型多功能纳米制剂,并探讨基于该纳米制剂的热疗和化疗对小鼠4T1乳腺癌细胞增殖以及迁移的影响。方法:1、材料表征:利用紫外-可见光-近红外分光光度计检测CNSI在特定光谱范围内的吸收性能。其余表征同第一章节。2、体外热响应性能的评估:分别检测不同浓度CNSI的微波热增敏性能（2450 MHz）和NIR-II区光热性能(0.8 W cm-2)。实验方法与第一章节相同。3、药物负载以及释放实验:将终浓度相同的CNSI与乳腺癌一线化疗药物注射用盐酸吡柔比星（THP）置于烧杯,经室温搅拌不同时间间隔后（0、3、6、9、12、15、19、24小时）,离心收集上清液,利用紫外分光光度计检测上清液在480 nm处的吸光度,最后通过公式计算药物荷载量:药物负载量（%）=CNSI吸附的THP的质量/初始添加的THP的总质量。为了评估药物的缓释特性,载有THP的CNSI被分散于PBS并转移至截留分子量为8000-14000 Da的透析袋内,将透析袋浸泡在含有100 m L p H=7.4 PBS（透析外液）的烧杯中进行避光透析（37℃、120 rpm）。同样,利用紫外分光光度计检测透析外液在480 nm处的吸光度并计算THP的累计释放量,绘制药物累计释放曲线。4、细胞层次评估热消融联合化疗协同抗肿瘤效果:通过CCK-8、细胞划痕实验以及克隆形成实验评估CNSI/THP对小鼠4T1乳腺癌细胞的杀伤效果。通过CCK-8以及死活染色实验评估CNSI/THP联合NIR-II区光热对肿瘤细胞的杀伤效果。5、淋巴示踪以及光声成像性能评估:肉眼直视下将CNSI注入小鼠髂下淋巴结,观察并记录淋巴引流方向以及淋巴结染黑情况。利用多光谱光声断层扫描仪评估CNSI在肿瘤以及前哨淋巴结的光声成像性能。结果:1、CNSI呈大小均一的球状,在生理溶液中团聚后尺寸约为150 nm。可见光-近红外吸收光谱表明该纳米材料在包括NIR-II区的光谱范围内呈全谱吸收。2、CNSI水溶液的温度随着材料浓度、微波暴露时间以及微波输出功率的增加而明显升高,且均高于对照组去离子水的温度变化。此外,良好的近红外吸收特性赋予CNSI优异的NIR-II区的光热转换性能,光热转换效率可达37.7%。3、室温搅拌20小时后,THP载药量可达0.7 mg/mg。37℃摇床孵育12小时后,CNSI/THP的累计释药量约为22.9%。上述结果表明CNSI具有较高的药物荷载以及药物缓释特性。4、划痕实验以及克隆形成实验结果表明,与对照组相比,CNSI/THP可以显著抑制4T1三阴性乳腺癌细胞的迁移（34.9±1.1%vs 25.3±1.8%,P＜0.05）和增殖（100±4.3%vs 24.8±4.6%）。CCK-8和死活染色实验进一步证实CNSI具有优异的光热性能,联合蒽环类化疗药物THP可协同抑制4T1三阴性乳腺癌细胞的增殖,并诱导最严重的肿瘤细胞死亡。5、活体水平证实了CNSI的淋巴示踪功能,且呈浓度依赖性和时间依赖性;明确了小鼠从髂下淋巴结到腋窝固有淋巴结的淋巴引流路径。体外光声成像结果显示CNSI的光声信号随着CNSI浓度的增加而显著增加。瘤内以及瘤周注射CNSI后,4T1原发肿瘤以及腋窝固有淋巴结部位的光声信号显著增强。结论:本研究制备了集微波增敏、NIR-II区光热、化疗以及光声成像于一体的新型多功能CNSI/THP纳米制剂,并联合热消融协同抑制小鼠4T1三阴性乳腺癌细胞的增殖和迁移。总结:综上所述,本论文聚焦于MWA在临床应用中面临的“缺乏选择性、单一疗效差”等问题,充分利用纳米材料改善肿瘤治疗问题的潜力,先后制备了包括Bi2Se3 NFs、六方相NaxWO3纳米晶体和多功能CNSI/THP纳米复合物在内的三个新型纳米微波增敏剂,逐步实现了从单一到联合,从抑制局部原发病灶到对抗淋巴转移的抗肿瘤疗效。该工作不仅为打破高危部位肝肿瘤MWA的局限性以及改善纳米材料可能的全身毒副作用提供新的解决思路,还深化了具有独特形貌的纳米材料的微波增敏效应研究,为进一步增强MWA的疗效提供了坚实的理论依据和实验基础,也为开发新型肿瘤微波增敏剂提供了新思路和新策略。