棉花黄萎病是一种由土传真菌引起的维管束病害,在世界各产棉区均有分布,其病原菌主要为大丽轮枝菌和黑白轮枝菌。病菌侵染棉株后,会使叶片黄化,干枯,进而导致棉株死亡。该病害致病机制复杂,具体抗性机制尚未明确,加之缺乏有效防治药物和抗病材料,使得棉花黄萎病防治愈加困难。从分子水平寻找抗性基因是研究棉花黄萎病的一个可行途径。由于棉花基因组较大等原因,此方面工作进展缓慢。拟南芥作为模式植物,是黄萎病菌宿主之一,基因组背景已知,也可作为植物黄萎病抗性机制的研究材料。本研究依托实验室构建的拟南芥与黄萎病菌的共同生长体系,筛选EMS诱变的拟南芥突变体库,鉴定了一批对黄萎病菌敏感的拟南芥突变体。vsad1-1突变体是筛选到的一个突变体,该突变体在受到病菌侵染后,叶片快速黄化、萎缩,花青素积累量极低,叶绿素和生物量下降。前期通过遗传学实验证明该突变体为单基因隐性突变。利用图位克隆技术,确定该突变基因位于拟南芥五号染色体上游,测序结果表明vsad1-1为基因At5g13930突变产生的突变体,基因突变导致其编码蛋白的第184位氨基酸由谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)。同期,我们还筛选到的另外一株黄萎病菌敏感型突变体vsad1-2,图位克隆结果表明,vsad1-1和vsad1-2为等位突变体,vsad1-2是该基因点突变产生,其第49位苏氨酸变为异亮氨酸。为了验证突变位点的正确性,我们先是使用了SALK的VSAD1基因点突变体tt4-2进行表型验证。在MS培养基上,突变体tt4-2和vsad1-1在黄萎病菌感染时植株表现出相似的发病特征:相比野生型而言,子叶过早黄化,花青素积累量极低,叶绿素含量下降,并且提前抽薹;土中侵染实验表明,tt4-2和vsad1-1突变体死亡率比野生型WT升高15%左右。再者,我们用构建的VSAD1基因超表达载体转化vsad1-1突变体,得到的超表达株系,植株花青素积累得到不同程度的恢复。以上结果说明,vsad1-1是由At5g13930基因发生突变导致。为了分析VSAD1基因受黄萎病菌诱导时的表达特征,实验提取受黄萎病菌侵染的植株叶片RNA,通过RT-PCR实验表明,植株受病菌侵染时,VSAD1基因表达量明显上调;同时,VSAD1:GUS转基因植株染色表明:正常状态下,植株各部分均有轻微染色,当植株受到黄萎病菌侵染时,在叶片、下胚轴以及根部的染色明显加深。植株GUS酶活性测定也表明,受黄萎病菌侵染后,植株的GUS酶活性上升43.6%。为了分析vsad1突变体对黄萎病菌的敏感性是否与其植株体内菌含量有关,论文参照已有文献中所报道的黄萎病菌β-微管蛋白序列,设计特异性引物VerACT,通过定量PCR技术检测植株体内黄萎病菌的含量。QRT-PCR结果表明vsad1-1体内大丽轮枝菌含量是WT的2.86倍。另据文献报道称VSAD1参与植物花青素的合成,论文设计了实验证明葡萄籽花青素提取物对黄萎病菌有一定的抑制作用,随着浓度升高,病菌生长减速。并且,我们从拟南芥叶片中提取花青素进行同样的抑制试验,结果同葡萄籽花青素效果基本一致,拟南芥叶片花青素可以抑制大丽轮枝菌生长。为了验证VSAD1是否参与棉花黄萎病菌的抗性反应,我们通过序列比对,找到了棉花中已公布的拟南芥VSAD1同源基因—GhCHS,两者氨基酸相似度达到85%。RT-PCR表明,在受黄萎病菌侵染后第15天时,棉花GhCHS表达量上调。通过VIGS技术,抑制棉花GhCHS的表达,使得棉株对黄萎病菌抗性减弱,棉花真叶过早黄化,发病指数升高8%左右。综合以上结果表明,VSAD1基因参与了植株黄萎病菌的应答反应。