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细胞核分离基因C(Nuclear distribution gene C,NudC)的表达产物NudC在真核生物的细胞分裂过程中起着关键作用,它在物种进化中保持了高度的保守性,其在果蝇、线虫、小鼠、人中均有表达。NudC与细胞的分裂、增殖、血细胞生成和肿瘤发生关系非常密切。NudC蛋白在细胞中发挥功能是被高度调控的,Polo样激酶1(Polo-like kinase1,PLK1)是目前发现的NudC的唯一上游调控激酶。我们利用免疫共沉淀偶联质谱技术,筛选出与一系列与NudC相互作用的蛋白分子,其中包括MEKK3。MEKK3(MAPK/ERK kinase kinase3,即mitogen-activated protein kinase kinase kinase3)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,激活后参与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号途径,与细胞周期调控、肿瘤发生、炎症反应和心血管疾病等相关。本课题就是要验证MEKK3和NudC之间相互作用的真实性以及探讨MEKK3是否为NudC的一个上游调控激酶。我们首先利用RT-PCR方法从人类肾脏胚胎细胞中扩增出MEKK3的cDNA片段,并将其分别克隆到带有FLAG标签的真核表达载体pCMV-tag-2c和带有GFP融和蛋白的真核表达载体pEGFP-C1中,构建野生型MEKK3的真核表达重组质粒FLAG-MEKK3 WT(WT即wide type,野生型)和GFP-MEKK3(GFP-MEKK3WT)。然后,我们应用重叠延伸PCR定点突变技术从质粒FLAG-MEKK3 WT中扩增激酶活性失活型的MEKK3 KD(MEKK3 Kinase dead,K391M),并将其克隆到带有FLAG序列标签的真核表达载体pCMV-tag-2c中,构建激酶活性丧失突变体FLAG-MEKK3 KD。我们将前期工作中已经扩增出的NudC的基因片断,连入真核表达载体pCMV-tag-2c和pEGFP-C1及携带GST融和蛋白的原核表达载体pGEX-5X-1中,构建了重组质粒FLAG-NudC、GFP-NudC和GST-NudC。然后,我们将构建的所有真核表达重组质粒转染到HeLa细胞中,检测其异源表达效率,发现其表达量均比较高。将重组质粒GST-NudC转化大肠杆菌DH5α,诱导表达并成功的纯化了GST-NudC融合蛋白。在此基础上,我们通过GST-Pull down技术,体外验证了MEKK3确实可以和NudC相互作用。我们将重组质粒共转到真核细胞HeLa中,应用免疫共沉淀技术证明MEKK3和NudC在体内也存在相互作用。随后,我们又利用体外模拟磷酸化实验证明,野生型FLAG-MEKK3 WT在体外可以磷酸化NudC,而激酶活性丧失突变体FLAG-MEKK3 KD无法将其磷酸化。磷酸化反应后的GST-NudC经小牛碱性磷酸酶CIP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)处理后,磷酸化条带消失,进一步证实了MEKK3能体外磷酸化NudC。激光共聚焦显微镜观察发现,当MEKK3和NudC在HeLa细胞中分别过量表达时,细胞产生相似的形态学特征,即细胞变圆,细胞出现半月核或肾型核,提示它们的过量表达可能与细胞凋亡有关。由于NudC在体内参与调控细胞周期过程,我们推测MEKK3可能通过磷酸化NudC而影响其功能,从而调节细胞增殖、分裂等生物学过程。