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腮腺分泌蛋白(PSP)由于它的功能与免疫相关,引起了人们的关注。为了弄清PSP的表达情况,以及它与α-AMY(α-Amylase)表达的关系,本研究根据已知的cDNA序列设计引物,利用RT-PCR、荧光定量PCR(Q-PCR)对猪及小鼠的PSP、AMY在腮腺生后发育不同时期的表达情况进行了研究。结果表明,猪与小鼠的PSP在腮腺生后发育的各时期都是高效表达的,而且PSP的表达量随发育期呈动态变化;并且与AMY的变化方向一致,推测二者存在协同性表达。随后的Northern杂交和Western杂交证实了,PSP在mRNA水平和蛋白水平也是高效表达的。
对猪PSP的全长氨基酸序列进行了抗原决定簇分析,推测猪PSP有4个抗原决定簇,分别位于PSP蛋白的22-37aa,41-59aa,180-195aa以及C-端。经过比较,按其中之一合成短肽,将短肽与匙孔血蓝蛋白连接,免疫家兔,获得了抗猪PSP抗血清。从蛋白质水平对其表达情况进行了研究。在整个研究过程中,将a-唾液淀粉酶及三磷酸甘油醛脱氢酶的表达情况作为对照。研究发现PSP在猪及小鼠中都呈腮腺特异性高效表达,表达量在不同发育期呈动态变化,且始终高于GAPDH。并且在6周龄小鼠腮腺中发现了一个20KDa的蛋白,能与PSP抗体发生反应。
在第二部分中,首先利用RLM-5’RACE进行了猪PSP转录起始位点的定位,结果表明,通过RLM-5’RACE得到的序列比现有的cDNA序列的5’端长39个碱基。分析发现,现有的猪PSP基因的开放阅读框(ORF)有误,猪ORF的真正起点(ATG)是在现存5’端上游22个碱基处。
随后用瞬时转染法对功能性启动子进行定位。首先成功地将普通转染载体改造为启动子分析专用载体。利用一系列嵌套引物对启动子区片段进行了扩增、克隆、亚克隆,成功构建了含有不同长度5’调控区的细胞转染载体。