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瘦素(Leptin)是由ob基因编码、在脂肪组织中生成的一种脂肪代谢调控产物,Leptin可有效调控个人机体脂质正常沉积以及个人体重异常变化。Leptin因此被广泛作为一种治疗肥胖以及其并发症的有效治疗方法和药物。Leptin在机体内可以发挥作用主要是通过Leptin受体信号分子传导途径完成;Plin5在机体内同时参与了脂解与脂合成过程;Leptin可直接导致PPAR家族相关分子表达发生变化,同时Plin家族基因表达也会直接受到PPARγ、PPARα等调控;有研究发现Leptin在体内可导致肥胖相关基因(fat mass and obesity associated,FTO)表达上调,FTO除了可调节体内脂肪代谢外,还会抑制机体内m~6A(N6-甲基腺嘌呤)甲基化修饰,它可介导m~6A去甲基化过程。而目前关于Leptin及FTO是否能够有效调控Plin5表达还未见到相关报道。本研究通过q PCR、Western blotting、免疫荧光、m~6A-IP等方法,探究Leptin通过FTO降低脂滴包被蛋白Perilipin5的m~6A甲基化,进而促进Perilipin5表达并促进脂代谢和能量代谢的作用机制。本研究结果将为深入研究Leptin与Perilipin5互作关系以及防止肥胖造成断奶仔猪脂肪代谢疾病提供证据。本试验得到以下结果:1. Leptin促进仔猪脂解并上调Plin5及下游基因表达。Leptin显著降低仔猪体增重、体脂率及血脂相关指标(P<0.05),高密度脂蛋白和体温显著升高(P<0.05)。Leptin处理断奶仔猪显著增加皮下脂肪组织Leptin和Lep R(P<0.05)表达水平;白脂中Plin5 m RNA和蛋白表达显著升高(P<0.05),其下游基因HSL、ATGL、LPL、ABHD5 m RNA表达显著升高(P<0.05);脂合成基因Acc1、Fasn m RNA水平显著降低(P<0.05);线粒体氧化基因和复合体基因m RNA水平显著上调(P<0.05);脂肪细胞体积和脂滴数量显著减小(P<0.05);说明Leptin促进Plin5及其下游脂解基因和线粒体功能基因表达。2. Leptin通过上调脂肪细胞中FTO抑制Plin5的m~6A甲基化。Leptin处理显著上调FTO和甲基化过程识别酶Ythdf2的m RNA水平(P<0.05);Dot Blot和总m~6A甲基化水平测定显示细胞总RNA m~6A甲基化水平显著下调(P<0.05),m~6A-IP检测Plin5 m~6A水平显著下调(P<0.05);超表达FTO(pc-FTO)显著降低(P<0.05)Plin5的m~6A甲基化水平,FTO干扰片段(si-FTO)则逆转这种作用(P<0.05);Leptin和pc-FTO共同处理会加剧总m RNA甲基化水平的降低(P<0.05),而si-FTO则逆转m~6A甲基化(P<0.05)的降低;Plin5的m~6A甲基化也与总m~6A甲基化水平(P<0.05)变化一致。以上结果表明Leptin处理抑制Plin5的m~6A甲基化水平,并且这种作用是由FTO上调造成。3. FTO通过抑制Plin5的m~6A甲基化上调Plin5蛋白水平。pc-FTO极显著上调Plin5的蛋白水平,但Plin5的m RNA水平没有显著变化(P>0.05),Plin5 m RNA的m~6A甲基化水平也显著降低(P<0.05);甲基化抑制剂环亮氨酸(Cycloleucine,CL)显著降低Plin5 m RNA的m~6A甲基化水平(P<0.05),甲基化激动剂甜菜碱(Betaine,Bet)极显著提高Plin5 m RNA的m~6A甲基化水平(P<0.01),同时Plin5 m RNA水平(P>0.05)无显著变化;CL显著提高Plin5的蛋白水平(P<0.05);甲基化位点突变后,pc-FTO对Plin5 m RNA的m~6A甲基化水平(P>0.05)的影响不显著,Plin5的m RNA水平(P>0.05)和蛋白水平(P>0.05)变化也不显著;以上结果说明FTO通过抑制Plin5的m~6A甲基化修饰水平上调其蛋白表达水平。4. Plin5在基础状态下促进脂滴降解,提高下游脂解基因和线粒体功能基因的表达。基础状态下成熟脂肪细胞超表达Plin5(pc-Plin5)后,脂滴的尺寸大小(P<0.05)显著降低,脂解相关基因如LPL、CPT1a和Plin5下游ATGL、HSL、ADBH5的m RNA(P<0.05)和蛋白水平(P<0.05)显著的上调,产热功能基因Pgc1a、Ucp1、Atp5a1的m RNA(P<0.05)和蛋白水平(P<0.05)显著上调,线粒体功能相关基因Tfam、NDUFB8、SDHB、UQCRC2、COX4I1 m RNA(P<0.05)和蛋白水平(P<0.05)以及下游ATP的生成也都显著的上调(P<0.05),NAD+/NADH比值显著升高(P<0.05);以上结果说明Plin5的上调可以促进脂滴表面脂解酶的作用,加速脂滴的分解,促进脂滴内甘油三酯的分解和线粒体呼吸链的运作,增加产热和能量代谢。5. 脂毒性状态下Plin5促进脂合成代谢和脂肪酸β-氧化并加速游离脂肪酸消耗。首先构建脂肪酸脂毒性模型,棕榈酸钠对细胞内Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2等与凋亡细胞相关基因的m RNA含量水平都与对照组无显著的差异(P>0.05),凋亡细胞数量增加量不显著(P>0.05),细胞中的游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)的含量极显著高于对照组(P<0.01),与对照组相比,脂滴蓄积显著增加(P<0.05),说明模型构建成功;pc-Plin5显著降低细胞内FFA含量(P<0.05),且β-氧化限速酶ACSL2以及甘油三酯合成酶DGAT2、FASN、ACC1的水平显著升高(P<0.05),线粒体复合体基因水平也显著上调(P<0.05),NADP+/NADPH比值也显著降低(P<0.05)。以上结果说明Plin5可以缓解游离脂肪酸过多造成的代谢紊乱,加速游离脂肪酸消耗;在脂毒性状态下Plin5可以促进脂合成代谢并增强线粒体β-氧化。本试验结果证明Leptin通过上调FTO表达抑制Plin5m~6A甲基化水平,进而上调Plin5表达;Plin5在基础状态下可通过激活下游脂解基因表达上调导致脂滴分解,进而促进产热;而在脂毒性状态下可增加游离脂肪酸消耗,保护机体脂质代谢平衡。本试验初步揭示了Leptin在Plin5调控和维持机体脂质代谢和能量消耗平衡中的重要作用,为深入研究肥胖及脂肪代谢异常综合征提供了理论依据。