第一部分呼吸道病毒高通量悬浮芯片检测方法的建立目的建立常见呼吸道病毒的悬浮芯片检测方法,实现呼吸道病毒的快速、高通量检测。方法(1)建立两组悬浮芯片检测方法,1组为流感病毒悬浮芯片检测方法,用于流感病毒型/亚型检测,包括季节性H1、季节性H3、新现的新甲型H1N1、高致病性禽流感H5及B型流感病毒；2组为常见呼吸道病毒悬浮芯片检测方法,检测15种常见呼吸道病毒,其中包括A、B型流感病毒(FluA、FluB)及新现的呼吸道病毒人博卡病毒(HBoV)、人偏肺病毒(HMPV)、WU多瘤病毒(WUPyV)、NL63型冠状病毒(Cov NL63)和HKU1型冠状病毒(Cov HKU1)。(2)引物和探针设计：流感病毒悬浮芯片检测方法(1组)引物和探针参照WHO推荐序列合成。常见呼吸道病毒悬浮芯片检测方法(2组)病毒的引物和探针设计如下：从GenBank下载不同呼吸道病毒的基因序列,用ClustalX进行序列比对后,找到每种病毒的基因保守序列,用Primier5.0和Oligo6.0软件在保守区设计引物和探针,尽量使不同病毒引物Tm值接近,引物扩增的目的片段大小在100bp-300bp之间。同时采用Oligo6.0软件对设计好的引物进行引物二级结构及互相之间形成引物二聚体的能力进行评价,根据评价结果将15对呼吸道病毒引物分为两个pool,用于多重PCR扩增。对探针序列进行blast比对,评价其特异性。(3)探针与微球耦联：按照微球供应商提供的方法进行探针与微球的耦联,并用倍比稀释的与探针互补的validation oligo进行耦联效果评价。1组用与季节性H1、H3、新甲型H1N1及B型流感病毒探针互补的validation oligo进行了耦联效果评价,2组用与OC43型冠状病毒(Cov OC43)、HMPV、FluA及FluB探针互补的validation oligo进行了耦联效果评价(4)多重PCR扩增及杂交条件优化：1组为5重PCR扩增,2组分为两个pool,1个为7重PCR扩增,另1个为8重PCR扩增。通过不同退火温度及引物浓度组合,优化反应条件及引物浓度。优化多重PCR反应条件后,在不同温度下将PCR产物与耦联有探针的微球进行杂交,用Bio-Plex 200检测仪进行检测,优化杂交温度。标本荧光强度值(MFI)=阴性对照标本5倍判断为阳性。(5)用本实验室保存的不同型/亚型的流感病毒毒株(H5亚型除外)按TCID50(半数组织细胞感染量)倍比稀释后进行1组悬浮芯片检测,评价敏感性和特异性。对本实验室保存的14种常见呼吸道病毒(副流感病毒2型(PIV2)除外)阳性标本及灭活H5亚型流感病毒培养液进行RT-PCR/PCR扩增,PCR产物纯化、定量后,10倍系列稀释核酸进行2组悬浮芯片检测(H5亚型纯化产物稀释液进行1组悬浮芯片检测),评价所建立方法的敏感性和特异性。(6)临床标本验证实验：按照以上建立的方法,对2009年1月采集的8份及2010年2月采集的100份流感样病例(ILI)的咽拭子标本进行1组悬浮芯片检测,并与WHO推荐的Real-time PCR方法检测结果进行比较。对2008年9月-2009年12月采集的88份下呼吸道感染患者的鼻咽吸取物(NPA)标本进行2组悬浮芯片检测,并与单引物PCR(检测HBoV及WUPyV)和多重PCR试剂盒(Seegeen,韩国)检测结果进行比较。结果(1)单引物PCR验证引物：用设计的不同呼吸道病毒特异的引物对已知呼吸道病毒阳性的标本进行单引物PCR扩增,均扩增出目的条带,说明设计的引物可用于后续多重PCR方法建立。(2)探针与微球耦联：不同稀释度vallidation olligo与微球杂交后MFI值均与vallidation olligo的稀释倍数成正比,最高稀释度的vallidation olligo与微球杂交后MFI值也在700以上,说明探针与微球耦联成功。(3)多重PCR扩增条件及杂交温度优化：用不同型/亚型流感病毒和已知病毒阳性的标本核酸进行梯度多重PCR扩增,1组和2组多重PCR的最佳退火温度分别为60℃和62℃。通过不同引物浓度组合比较,确定了多重PCR的最佳引物浓度。1组和2组悬浮芯片检测方法的最佳杂交温度分别为54℃和50℃。(4)敏感性：1组悬浮芯片检测方法的敏感性为季节性H1N1亚型5TCID50/mL、季节性H3N2亚型0.05 TCID50/mL、新甲型H1N1 0.05 TCID50/mL、B型5TCID50/mL及H5亚型10-8ng/μL; 2组悬浮芯片检测方法的敏感性为HMPV 10-8ng/μL、HBoV 10-9ng/μL、WUPyV 10-8ng/μL、Adv(腺病毒)10-8ng/μL、Cov OC43 10-8ng/μL、Cov 229E (229E型冠状病毒)10-7ng/μL、Cov NL63 10-8ng/μL、Cov HKU1 10-8ng/μL、PIV1 (副流感病毒1型)10-9ng/μL、PIV3(副流感病毒3型)10-9ng/μL、HRV(鼻病毒)10-7ng/μL、RSV(呼吸道合胞病毒)10-8ng/μL、FluA 10-9ng/μL、FluB 10-8ng/μL。(5)特异性：用1组和2组悬浮芯片方法检测不同型/亚型流感病毒或不同种类呼吸道病毒,病毒之间均无交叉反应。(6)108份咽拭子标本进行1组悬浮芯片检测,结果与Real-time PCR检测结果完全一致,符合率100%。88份NPA标本进行2组悬浮芯片检测,与多重PCR试剂盒(Seegeen)及单引物PCR结果进行比较,2组悬浮芯片方法检测不同呼吸道病毒的灵敏度为50.0%M00.0%,特异度为96.4%-100.0%,阳性预期值为33.3%-100.0%,阴性预期值为94.8%-100.0%,符合率为93.2%-100%。结论本文成功建立了包括新现呼吸道病毒(新甲型H1N1流感病毒、HMPV、HBoV、WUPyV、Cov NL63及Cov HKU1)在内的流感病毒和常见呼吸道病毒悬浮芯片检测方法,并对实验条件进行了优化,确定了最佳实验方案。该方法的敏感性、特异性均较好,检测时限为6h,同时可检测15种常见呼吸道病毒及5种型/亚型流感病毒。第二部分新现呼吸道病毒的分子特征分析目的研究新现呼吸道病毒新甲型H1N1流感病毒、HMPV、HBoV及WUPyV的感染状况及病毒相关基因特性。方法(1)用病毒分离或Real——time PCR法,对2009年4月-2011年3月采集的IL1咽拭子标本和重症呼吸道感染患者的NPA、鼻咽拭子及气管盥洗液等呼吸道标本进行包括新现甲型H1N1在内的流感病毒检测。并对分离自上述病例中重症/死亡病例的14株新甲型H1N1流感病毒毒株进行HA基因序列测定,其中6株进行NA基因序列测定,3株进行全基因组序列测定,分析序列特征,绘制种系发生树。(2)采集2006年和2008年春季、2008年和2009年秋冬季的急性呼吸道感染住院儿童的310份NPA标本,进行巢式RT-PCR扩增HMPVN和F基因片段,RT-PCR扩增G基因,并对扩增阳性产物进行序列分析,绘制种系发生树。同时收集所有阳性患者的临床资料。并采用PCR和多重PCR对HMPVN基因阳性标本进行其他呼吸道病毒检测。HMPV检测阳性标本同时用Vero-E6和LLC-MK2细胞进行病毒分离。(3)采集2008年春季、2008年秋冬季和2009年冬春季的急性下呼吸道感染住院儿童的238份NPA标本,采用PCR检测HBoV NP-1基因片段,并对VP1/VP2基因进行PCR扩增和序列分析,绘制种系发生树。同时采用PCR和多重PCR检测其它呼吸道病毒。(4)采集2008年春季、2008年秋冬季和2009年冬春季的急性下呼吸道感染住院儿童的NPA标本238份,2009年冬季的急性上呼吸道感染的咽拭子标本68份以及2009年2月-11月对照组咽拭子标本43份,进行WUPyV VP2基因片段PCR扩增,同时对扩增阳性标本采用PCR和多重PCR检测其他呼吸道病毒。结果(1)流感病毒2009年4月-2011年3月共检测呼吸道标本7931份(其中ILI咽拭子标本6177份,重症呼吸道感染病例呼吸道标本754份),1567份(19.8%)检出流感病毒。2009年4月-2009年9月、2009年10月-2010年3月、2010年4月-2010年9月和2010年10月-2011年3月四个监测季流感病毒优势流行亚型分别为季节性H3(60.8%,185/304)、新甲型H1N1(76.8%,630/820)、季节性H3(77.6%,118/152)和新甲型H1N1(51.5%,150/291)。四个监测季中季节性H3亚型流感病毒HA基因变异较小,属抗原漂移。(2)新甲型H1N1流感病毒：1567份流感病毒阳性标本中,56.3%(882/1567)为新甲型H1N1流感病毒。25.5%(192/754)的重症呼吸道感染病例为新甲型H1N1流感病毒阳性。不同监测季新甲型H1N1流感病毒在所有流感病毒中的构成比如下：2009年4月-2009年9月为33.6%(102/304),2009年10月-2010年3月为76.8%(630/820),2010年4月-2010年9月为0.6%(1/152),2010年10月-2011年3月为51.5%(150/291)。新甲型H1N1流感病毒为2009年10月-2010年3月和2010年10月-2011年3月两个监测季的优势流行亚型。种系发生分析显示,新甲型HIN1流感病毒的HA、NA、M、NP和NS基因来源于猪流感病毒,PB2和PA基因来源于禽流感病毒,PB1基因来源于人流感病毒。天津地区新甲型H1N1流感病毒8个片段与WHO推荐的疫苗株A/California/07/2009(H 1N1)及中国的代表株A/Sichuan/1/2OO9(H1N1)相比,同源性很高,为98.2%-99.5%。HA基因氨基酸序列与疫苗株比较,未发现受体结合位点变异。NA基因氨基酸序列分析显示,天津地区新甲型H1N1流感病毒对神经氨酸酶抑制剂(如达菲)敏感。(3) HMPV310份NPA标本中共检出20份(6.5%)HMPV。HMPV阳性患儿的临床诊断均为支气管肺炎,其临床症状以咳嗽、喘息、呼吸急促、发烧等常见。HMPV阳性患儿的年龄中位数为15.0个月(16d-9岁),其中=2岁患儿占90.0%(18/20)。男性占60.0%(12/20)。17株HMPVN基因和18株HMPVF基因种系发生树分析显示,14株为A型(其中13株为A2b亚型),6株为B型。A、B型间临床特征未见明显差别。G基因变异最大,N和F基因片段相对保守。2例HMPV阳性患儿分别与腺病毒和鼻病毒混合感染。HMPV的细胞分离较困难,用Vero-6细胞从PCR阳性标本中成功分离到HMPV, Vero-E6分离HMPV优于LLC-MK2。(4) HBoV238份NPA标本中,17份(7.1%)为HBoV阳性。所有阳性患儿的年龄均=6y,男14例,女3例。6月-1y患儿感染率最高,为16.0%(8/50)。17例HBoV阳性患儿均为肺炎和喘息性支气管炎患者。14份(82.4%)合并其它呼吸道病毒感染。13株HBoVVP1/VP2基因扩增成功,VPl/VP2基因序列种系发生分析表明,13株HBoV均与瑞典分离的代表株ST2株(1b簇)聚在一个分支上,均属于1b簇。(5) WUPyV238份下呼吸道感染的NPA标本中,45份(18.9%)WUPyV VP2基因阳性。阳性患儿年龄中位数为9.0个月(6d-6y),=6个月检出率最高(37.8%,17/45),男28例,女17例。WUPyV阳性标本中,80%(36/45)与其他呼吸道病毒混合感染,其中RSV B占35.6%(16/45)。68份门诊上呼吸道感染儿童的咽拭子标本中,仅4.4%(3/68)为WUPyV VP2基因片段PCR扩增阳性,与上述下呼吸道感染的阳性率18.9%相比,差异有统计学意义(X2=8.4,P=0.0037)。43例对照组儿童的咽拭子标本经WUPyV VP2基因检测均为阴性。结论(1)流感病毒是冬春季重点监测的呼吸道病毒,2009年4月-2011年3月4个监测季的优势流行亚型分别为季节性H3、新甲型H1N1、季节性H3和新甲型H1N1。季节性H3亚型流感病毒HA基因变异属抗原漂移。(2)天津地区2009年6月出现新甲型H1N1流感病毒,2009年10月-2010年3月达流行高峰(76.8%),2010年4月-2010年9月急剧下降(0.6%),2010年10月-2011年3月又成为优势流行亚型(51.5%)。新甲型H1N1流感病毒可引起肺炎等重症呼吸道感染。新甲型H1N1流感病毒的HA、NA、M、NP和NS基因来源于猪流感病毒,PB2和PA基因来源于禽流感病毒,PB1基因来源于人流感病毒,其为三重重排病毒,与国外报道一致。目前的新甲型H1N1流感病毒基因与国外毒株相比,无显著变异。NA氨基酸序列分析表明,天津地区无达菲耐药株出现。(3) HMPV、HBoV及WUPyV均在下呼吸道感染患者中检出率高,且都有混合感染。天津地区流行的HMPV以A2b为优势流行型,HBoV均属于1b簇。