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前言:
环境致癌因子苯并(a)芘(Benzo[a]pyrene,B(a)P)广泛存在于环境中,是多环芳烃类化合物的典型代表。B(a)P在机体内经肝微粒体酶活化系统代谢活化后形成终致癌物二氢二醇环氧苯(a)芘(Benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide(±),(anti),BPDE),BPDE与DNA结合形成DNA加合物,造成DNA损伤,可诱发皮肤癌、肺癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌等多种癌症。
癌症是多基因、多因素参与,多阶段发展的复杂过程,是环境因素和遗传因素共同作用的结果。在相同的环境暴露下,只有少数人会发生肿瘤,说明易感性在肿瘤的发生发展中有着不可忽视的作用。有资料表明,DNA损伤修复能力的个体差异是决定肿瘤易感性的重要因素,而个体DNA修复能力与DNA修复基因的单核苷酸多态(Singlenucleotidepolymorphisms,SNP)密切相关。核苷酸切除修复交叉互补基因2(excisionrepaircrosscomplementationgroup2,ERCC2),又称为着色性干皮病基因D(xerodermapigmentsumgroupD,XPD),是一种重要的DNA修复基因,它所编码的ERCC2/XPD蛋白,是TFⅡH复合物的亚单位,是核苷酸切除修复(NucleotideExcisionRepair,NER)中的关键因子。在NER途径中,DNA损伤被特定的蛋白识别后,TFⅡH复合物发挥其5→3DNA解旋酶作用,打开受损位置的DNA双链,使受损DNA被特异性核酸内切酶切除,完成DNA损伤修复。近年来关注较多的ERCC2/XPD基因的SNP有密码子751(A→C)、312(G→A)和156(C→A)。流行病学研究结果显示,ERCC2/XPD基因SNP与肺癌、皮肤癌、食管癌、膀胱癌、头颈癌等多种肿瘤的易感风险密切相关,但结论不尽相同。ERCC2/XPD基因Lys751Gin、Asp312Asn和Arg156Arg位点的基因频率分布具有明显种族、地区差异。因此,健康人群DNA修复能力与ERCC2/XPD基因751、312和156位点SNP的相关分析对中国东北地区汉族人群筛选肿瘤易感性位点有重要意义,有助于阐明肿瘤发病机制,估计人群发病风险,找寻意义确切的肿瘤易感生物标志,对于肿瘤的早期发现及合理治疗具有重要意义。
本研究以沈阳地区汉族健康人群为研究对象,提取外周血基因组DNA,检测ERCC2/XPDLys751Gin(rsl3181)、Asp312Asn(rs1799793)和Arg156Arg(rs238406)位点的基因型,同时培养外周血淋巴细胞,用环境致癌因子B(a)P体外诱导BPDE-DNA加合物的形成,采用高效液相色谱法和改良彗星实验精确评价个体DNA损伤修复能力,分析ERCC2/XPD不同基因型和单体型对于DNA损伤修复能力的影响,试图探讨环境致癌因子所致DNA损伤的修复能力的个体差异与ERCC2/XPD基因多态及其表达的关联,找寻意义确切的肿瘤关联性生物标志物,进而试图阐明基因.基因、基因一环境间的交互作用及其机制,为NER通路肿瘤关联性生物标志物的研究提供科学依据。
研究方法:
1、研究对象的确定
自2010年10月至2011年5月,收集沈阳市成年汉族健康人外周血818例,填写简单调查问卷并记录人口学特征、既往病史、家族史及生活方式(吸烟、饮酒)等一般状况。研究对象排除肿瘤、遗传性疾病、重度感染等疾病,告知研究对象并签署知情同意书后实施研究计划。
2、个体淋巴细胞DNA损伤修复能力的评定
2.1BPDE-DNA加合物水平测定(高效液相色谱法)。
2.2B(a)P所致DNA损伤水平测定(改良彗星实验)。
3、淋巴细胞DNA修复能力与ERCC2/XPD多态性关联性分析
3.1Tris平衡酚-氯仿法于抗凝外周血中提取DNA;Nanodrop仪测量DNA浓度及OD260/OD280比值
3.2TaqMan(R)荧光实时定量PCR法检测ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181),Asp312Asn(rs1799793)和Arg156Arg(rS238406)的基因型
3.3ERCC2/XPDLys751Gln(rsl3181),Asp312Asn(rs1799793)和Arg156Arg(rs238406)基因型在人群中的分布频率及连锁不平衡性分析
3.4DNA修复能力与ERCC2/XPD各位点SNP及单体型的关联分析
4、BPDE-DNA加合物损伤修复的多因素分析
5、ERCC2/XPD基因表达水平的分析
5.1实时定量PCR检测BPDE染毒后ERCC2/XPDmRNA表达水平;
5.2分析ERCC2/XPDmRNA水平在Arg156Arg(rs238406)不同基因型间的差异
结果:
1、ERCC2/XPD基因各位点SNP在人群中的分布频率及连锁不平衡分析
ERCC2/XPDLys751Gin、Asp312Asn和Arg156Arg基因多态均符合Hardy-Weinberg平衡定律,P＞0.05;各位点间存在连锁不平衡:Asp312Asn(rs1799793)与Arg156Arg(rs238406)(D=1.0,R2=0.059);Lys751Gln(rs13181)与Asp312Asn(rs1799793)(D=0.503,R2=0.247);Lys751Gln(rs13181)与Arg156Arg(rs238406)(D=0.779,R2=0.036)
2、BPDE-DNA加合物水平与人群基本特征、ERCC2/XPDSNP及其单体型的关联性分析
BPDE-DNA加合物水平与年龄和ERCC2/XPDArg156Arg位点的SNP有关,50-69岁和≥70岁年龄组个体的加合物水平显著高于＜30岁年龄组个体(P＜0.05);携带ERCC2/XPDArg156Arg位点AA基因型个体BPDE-DNA加合物水平显著高于CC基因型携带者(P＜0.05);多元线性回归分析显示,ERCC2/XPDArg156Arg位点SNP及年龄对BPDE-DNA加合物含量的影响有统计学意义(P＜0.05),多元线性回归模型显示ERCC2/XPDArg156Arg位点SNP对BPDE-DNA加合物的影响程度为0.194,年龄为0.082:单体型分析显示,含ERCC2/XPDArg156Arg(rs238406)位点A等位基因的个体有较高水平BPDE-DNA加合物(P＜0.05)。
3、改良彗星实验法检测B(a)P所致DNA损伤修复能力与人群基本特征及ERCC2/XPD各位点SNP的关联性分析
DNA损伤修复能力与年龄及ERCC2/XPDArg156Arg位点SNP有关。在50-69岁和≥70岁年龄组个体的彗星尾距比值高于＜30岁年龄组个体,≥70岁年龄组个体的彗星尾部面积比值高于＜30岁年龄组个体(P＜0.05);携带ERCC2/XPDArg156Arg位点AA基因型个体的彗星尾距比值、尾部面积比值均高于CC基因型携带者(P＜0.05)。
4、B(a)P所致DNA损伤水平的综合评分与人群基本特征和ERCC2/XPD各位点SNP的关联性分析
多元线性回归分析表明ERCC2/XPDArg156Arg位点SNP和年龄对DNA损伤水平综合评分的影响有统计学意义,多元线性回归模型显示ERCC2/XPDArg156Arg位点SNP对DNA损伤水平综合评分的影响程度为0.223,年龄的影响程度为0.203。
5、BPDE处理后ERCC2/XPDmRNA表达水平与ERCC2/XPDArg156Arg位点SNP的关联性分析
BPDE处理后的ERCC2/XPDmRNA表达水平在ERCC2/XPDArg156Arg位点各基因型间无明显差异(P＞0.05)。
结论:
1、ERCC2/XPDArg156Argrs238406位点A等位基因会增加淋巴细胞高水平BPDE-DNA加合物的风险,与个体DNA损伤修复能力降低相关联。
2、ERCC2/XPDArg156Arg不同基因型的淋巴细胞在经BPDE染毒处理后ERCC2/XPDmRNA的表达水平未见明显差异,ERCC2/XPDArg156Arg(rs238406)是否可作为意义确切的肿瘤遗传易感生物标志尚待明确。
3、本研究中BPDE-DNA加合物水平与ERCC2/XPDLys751Gin和Asp312Asn位点的基因多态无关。ERCC2/XPDArg156Arg(rs238406)、Lys751Gin(rs13181)及Asp312Asn(rs1799793)位点SNP及单体型的功能研究将对于找寻意义确切的肿瘤遗传易感生物标志具有重要价值。