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细菌RNA聚合酶（RNAP）的σ因子对特定启动子序列的识别和结合决定了特定阶段和条件下细胞内基因表达的差异,是原核生物基因表达中最为保守的初级调控方式。除了决定细胞生存必须的主要σ因子外,多数细菌都编码有可替代σ因子,它们在诸如膜胁迫、营养获得、发育分化等广泛的细胞生理生化过程中发挥重要作用。胞质外功能σ因子（Extracytoplasmic Function sigma factor, ECFσ）是可替代σ因子中数量最多、序列最为多变的一类小的调控蛋白,一般受到跨膜的anti-σ因子调控,是原核生物感知和应答环境变化的重要的信号传导与调节机制之一。典型的粘细菌是一类以土壤为主要生境且分布广泛的环境微生物,拥有包括多细胞营养扩展、子实体形成和孢子分化在内的复杂生活周期。该类群拥有目前已知最大的细菌基因组,编码大量的ECF σ因子,推测它们在粘细菌适应多变自然生境、完成生活史中发挥重要作用,但尚缺乏系统的研究。通过对模式菌株基因组序列的生物信息学分析,我们从其编码的ECFσ/anti a基因中选择了尚未有报道的31个ECF σ因子和14个ECF anti-σ因子进行研究。我们首先利用同源重组敲除法,在模式菌株Myxococcus xanthus DZ2中成功构建了45个ECF σ/anti-σ单因子缺失突变株。鉴于ECF a因子主要是对胞外信号进行应答,而粘细菌的生态分布又较为广泛,我们首先选择了温度、pH、氧化水平、盐和渗透压力等非生物环境信号进行研究。对于每个信号分别设置5-10不同的梯度,测定背景株的生长情况并选择亚适生长条件作为后续分析的信号参数,分别是：温度26℃和35.5℃,酸碱度pH 6.4和pH 8.8,3%甘露醇,100mMNaCl和5 mM H2O2。在确定了上述具体信号和参数之后,我们深入比较了所有突变株与野生株在这些条件下的营养生长情况。在正常培养条件下,所有突变株的生长与野生菌株DZ2没有明显变化,符合ECFa因子为可替代a因子的作用特点。而在设定的压力条件下,许多突变株的生长减慢,提示相应的ECF a因子在该种环境信号应答中发挥作用。经过复筛验证,我们获得了与野生株生长曲线显著不同的11株突变株,其中有5株仅在某一种研究条件下生长减弱,分别为MXAN 2395、MXAN 3686、MXAN 3959、MXAN4315和MXAN6174基因敲除突变株,提示它们可能是特异性应答相应刺激。另外6株即MXAN 4147、MXAN 4148、 MXAN 4987、MXAN 6460、MXAN 6461和MXAN7214基因敲除突变株则在两种及以上设定条件下均出现了生长变化,提示它们可能应答多种环境变化。营养匮乏引发的多细胞子实体发育及抗逆性粘孢子分化是粘细菌最为显著的特征,这一过程受到严格的时间和空间调控,涉及到包括诸多调控途径如双组份系统等在内的复杂调控网络。但除了营养匮乏外,这一过程是否也会受到其他外界不利环境的影响?ECF a因子是否也参与了该过程的信号传导与调控?为了解答这些问题,我们比较了所有突变株与野生株在添加和不添加10 mM H2O2条件下的运动、子实体形成和孢子萌发率。结果显示,氧化压力条件下,与野生株相比,有25突变株与DZ2的运动不同,其中既有单独影响个体或者群体运动能力的,亦有同时影响两种运动能力的。而ECF a因子对于发育和生孢的影响则更为多样,例如,有7株突变株与正常饥饿信号刺激下的发育相关,进一步的功能鉴定将可以补充现有的粘细菌子实体发育信号途径。另有5株突变株与DZ2在正常条件下的发育和生孢率无明显差别或相对氧化压力下的差异较小,而在氧化压力条件下,其中3株MXAN4316, MXAN5410和MXAN7288基因缺失突变株现为发育延迟,生孢率明显降低,而MXAN 2394则表现为发育提前,生孢率明显升高,另1株和MXAN4986基因缺失突变株的生孢率也明显升高。初步证实多种不利环境变化均可诱发粘细菌的发育分化过程。以上结果提示,ECF a因子对黄色粘球菌的运动、子实体形成和生孢等均发挥着广泛而复杂的调控作用。综合所有突变体表型,我们发现MXAN 6461基因缺失的性状最为显著,在高温、酸、碱、盐和氧化压力信号下它的生长都比野生株慢,且在营养匮乏条件下不能正常发育,也无法形成抗逆性的粘孢子。本论文最后部分对其进行了深入研究。我们首先通过基因回补实验确证了突变株的所有缺陷性状均由该基因缺失导致。qRT-PCR分析显示,野生株中的MXAN 6461基因在35.5 ℃、pH6.4、/pH8.8,3%甘露醇,100mM NaCl和5 mM H2O2条件下的表达量都有不同程度的提高,这与其条件下的生长表型相一致,说明该因子确实作为广谱性ECF σ因子参与粘细菌对高温、酸、碱、盐和氧化胁迫等环境信号的应答。转录分析同时显不,MXAN6461与其上下游基因MXAN6457- MXAN6462共转录。将MXAN6461异源表达纯化后进行了bandshift试验,结果显示其所在operon的启动子序列位于MXAN 6462基因上游500bp内。该基因簇中的MXANJ460预测编码MXAN6461的auti-σ因子。我们利用细菌双杂交试验证实MXAN6460和MXAN6461的编码产物确实存在相互作用。这些结果初步揭示了ECF a因子MXAN6461的信号传导机制。综上所述,本论文系统研究了M. xanthus中ECF a因子在不同环境压力下的生长、运动、发育和孢子萌发等表型,对其中表型显著的ECF a因子进行了调控机制分析,为进一步研究鉴定不同ECF a因子的信号传导及应答机制奠定了扎实的基础。