乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一个影响全人类健康的主要公共卫生问题,乙型病毒肝炎是感染乙型肝炎病毒后引起的以肝功能损伤为主的全身性传染病,全球有20亿人血清学显示其曾感染过HBV,其中有3.5亿多人发展成为慢性HBV携带者,部分慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)患者会死于乙型肝炎所致的肝硬化和肝癌,给病人、家庭、社会带来了沉重的经济负担。目前,我国育龄期妇女HBsAg流行率约为6.6%,估算每年仍有100万名新生儿出生后面临感染HBV的高风险。2016年发布的《全球卫生部门病毒性肝炎战略》首次提出到2030年消除病毒性肝炎对公共卫生威胁的全球性目标,而“HBV母婴零传播”是实现该目标的重要一环,因此,中国肝炎防治基金会建立“乙肝母婴零传播工程项目”,贵州医科大学附属医院为全国第6家签订完成该项目单位。本课题将回顾性分析研究贵州高风险乙型肝炎孕妇(HBsAg、HBeAg双阳性,H3V DNA≥106 IU/ml,或第一胎已被感染HBV或孕妇本人就为乙肝母婴传播感染者),分为孕期药物干预组及门诊非干预组与对照组(非乙型肝炎孕妇)及其出生的新生儿/婴幼儿,研究干预组孕期HBV病毒基因型及免疫功能变化与对抗病毒药物作用影响,其所生新生儿/婴幼儿在乙型肝炎疫苗及乙型肝炎免疫球蛋白联合标准规范免疫接种后,HBV母婴传播感染率及产生抗-HBs滴度。针对母婴传播患者,通过二代测序分析,判断母婴病毒全基因序列同源性及发现有宫内传播优势的特异突变位点。为HBV母婴传播感染发生机制及防控提供临床真实研究数据。所有研究人群均通过贵州医科大学附属医院伦理委员会审核同意通过。研究内容分为三部分报告。目的:1.观察孕期使用抗病毒药物阻断对贵州地区不同基因型高风险乙型肝炎孕妇HBVDNA 及 HBVRNA 的影响。2.对贵州地区高风险乙型肝炎孕妇母婴传播阻断后母婴结局观察。3.探索乙肝病毒宫内感染的无创性产前诊断。方法:第一部分,回顾性收集2016年05月-2018年05月在贵州医科大学附属医院感染科及产科门诊,入选患者诊断符合2015年修订的《慢性乙型肝炎防治指南》[2]的诊断标准,在孕12周前就诊查确诊慢性乙型肝炎CHB患者孕妇,均为HBsAg(Hepatitis B surface antigen,HB sAg)阳性持续超过6个月,并在孕24周前B超检查提示胎儿发育正常,血清丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)、人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)、梅毒螺旋体抗体(Treponema pallidum antibody,RPR)标志物阴性,无先兆流产史。排除标准:①丈夫有HBV感染;②孕前半年内有使用干扰素治疗CHB患者;③孕期伴有其他类型的肝病,糖尿病,甲状腺疾病,高血压、慢性肾病,肿瘤,精神类等慢性疾病史;④肝硬化失代偿期患者;⑤产前B超提示胎儿发育异常或畸形。根据孕24周-28周是否抗病毒阻断分为两组:干预组(T)91例,未干预组(NT)259例,同期我院产科门诊体检健康非乙型肝炎孕妇(Health control,HC,定义为HBsAg阴性,肝功正常,既往无肝炎病史)作为对照组(C)100例。按照乙肝孕妇抗病毒指南,干预组均以阻断为目的,自愿在24-28周开始接受服用替诺福韦或者替比夫定抗病毒治疗直至分娩。开展人口统计学和临床特征调查并分别于孕12-24周,孕28-32周,孕36-40周采集血液样本,检测基因型,HBsAg、HBeAg、HBVDNA、HBVRNA,肝功能[丙氨酸转氨酶(ALT)\天门冬氨酸氨基转移酶(AST)\总胆红素(TBIL)\总胆汁酸(TBA)\胆碱酯酶(CHE)\碱性磷酸酶(ALP)及对照组,未干预组,干预组在用药前(孕12-24W)及干预组分娩前(36-40周)检测T淋巴细胞(CD3+,CD4+CD8+),NK 细胞(CD16+CD56)及 B 淋巴细胞(CD19)的变化。干预组均以阻断为目的,在孕24-28周开始口服富马酸替诺福韦二吡呋酯片(TDF)300 mg/d,购自葛兰素史克(天津)有限公司(国药准字H20153090);或替比夫定(LDT)600 mg/d,购自北京诺华制药有限公司(国药准字H20070028),抗病毒治疗直至分娩。数据采用连续变量以均数±标准差;分类变量以率进行统计分析。第二部分,研究人群为第一部分孕妇[非干预组(NT)259例,干预组(1)91例,对照组100例(C))]及其所生婴幼儿(450例),干预组及未干预组孕妇所生新生儿/婴幼儿均采取国家标准乙型肝炎计划免疫主被动联合接种(出生6 h内肌肉注射乙型肝炎免疫球蛋白100U,及0、1、6个月每次肌肉注射基因工程乙型肝炎疫苗10 μg),对照组只注射乙型肝炎疫苗(0、1、6个月每次肌肉注射基因工程乙型肝炎疫苗10μg)。观察孕周及孕期不良反应,新生儿Apgar评分,及其幼儿7个月龄时定量检测血清乙型肝炎标志物(hepatitis B virus marker,HBVM)及 HBV DNA。HBV 母婴传播感染定义为乙型肝炎孕妇所生小孩出生后在7月龄后检测HBsAg阳性,或伴有HBV DNA阳性。数据统计:两两比较用LSD方法,组间比较,采用t检验,疗效分析采用协方差分析,组内比较采用符号秩和检验。第三部分,研究人群为第一部分孕妇(干预组91例及非干预组259例)及其所生婴幼儿(350例),HBV孕妇于孕16-24周采血10ml进行二代测序,预测胎儿是否发生宫内感染(由贵州省产前诊断中心完成),并已收集临床信息与血液样本。在充分考虑感染组与非感染组之间孕妇年龄和怀孕周数等特征分布平衡的基础上,从中挑选出一个包括128对母婴的样本测试集,其中经产后随访证实其中29例(均为第一部分未干预者)发生宫内感染,未发生宫内感染的母婴99对。通过孕妇血样中病毒DNA及胎儿游离DNA的提取和采取Illumina HiSeq 2000平台的测序分析,判断母婴病毒全基因序列同源性及发现有宫内传播优势的特异突变位点。统计学方法:组间比较,采用t检验,组内比较采用符号秩和检验。采用R软件3.2.3版本提供的“randomForest”工具包构建随机森林模型。结果:第一部分,对干预组91例e抗原阳性或和高载量病毒复制乙肝孕妇进行HBV基因分型:B型57例(57/91,62.63.18%),C型34例(34/91,37.36%),未发现其他基因类型。干预组用替诺福韦(TDF)和替比夫定(LDT)在人口统计学和临床特征方面没有差异,包括肝功能检查[TDF 治疗前:ALT21.30(9.01-362.49),AST 25.19(13.62-345.53),TBIL8.16(3.79-57.55),ALP78.44(31.00-232.52),TBA3.70(0.83-45.23),治疗结束时:ALT 21.30(8.66-98.10),AST 24.65(14.91-101.92),TBIL 8.78(3.16-17.11)),ALP 148.05(53.98-470.61),TBA 3.07(0.92-74.83)];LDT 组治疗前:ALT22.56(6.65-117.00))AST23.02(16.37-62.00),TBIL7.81(5.48-18.27),ALP67.35(46.05-388.21),TBA3.24(1.06-42.58),治疗结束时:ALT 21.40(8.14-62.05),AST 24.10(11.79-160.64),TBIL 7.28(3.50-18.40),ALP 162.40(47.30-423.96),TBA 3.76(0.69-28.41)]。Log10(HBV DNA)和 Log10(HBV RNA)[TDF 组(治疗前:HBVDNA 4.84±2.01,HBVRNA6.35±1.10;治疗 4 周时:HBVDNA3.99±0.79,HBVRNA 6.05±0.94;治疗结束时:HBVDNA 3.06±0.66,HBVRNA 5.52±0.85;LDT 组(治疗前:HBVDNA5.08±1.99,HBVRNA6.47 ± 0.88;治疗 4 周时:HBVDNA4.45±1.18,HBVRNA6.51±0.82;治疗结束时:HBVDNA3.51±1.20,HBVRNA6.13±0.66)],与治疗前(孕12-24周)相比,替诺福韦与替比夫定在治疗结束时,Log10(HBVDNA)和Log10(HBV RNA)显著降低(P<0.05)。在排除其他变量的影响下,HBV基因型对HBVRNA载量有一定的影响,表现在C基因组的患者HBVRNA在治疗结束时比B基因组的患者少下降了 0.54个单位(logl0),P值(0.01)<0.05。孕期CD3+及CD19细胞在各组中变化不大,而未干预组及干预组在用药前CD4+T细胞及CD8+T细胞较正常孕妇比较,其表达减低统计学有差异(P<0.05),干预组用药后较用药前CD4+T细胞及CD8+T细胞表达增加,但CD4+T细胞增加更为明显,表达有统计学差异(F=9.38,P<0.01),干预组用药后较正常对照组有差异,但无统计学意义,NK细胞(CD16+CD56)在未干预组及干预组用药前较对照组下降,有统计学差异(F=8.72 P=0.014)。第二部分HBV母婴结局观察到未干预组婴幼儿有乙型肝炎感染,表现为HBsAg 阳性(29/259,11.19%),HBeAg 阳性(24/259,9.26%)及 HBV DNA 阳性(27/259,10.24%)。HBV母婴传播感染率为11.19%(29/259),进一步分析非干预组婴幼儿HBV感染与母亲HBV DNA载量的关系,当母亲HBV DNA ≥ 106 IU/ml,其母婴传播感染高达38.67%(29/75),本研究中母婴传播感染组其母亲HBV DNA均大于106 IU/ml,其中,HBeAg阳性15例,HBeAg阴性14例,针对二胎HBV孕妇(第一胎被感染HBV)中,未干预组有1例感染HBV。未干预原因主要由于孕妇就诊时间较晚,就诊时为孕38周,孕妇HBV DNA>106 IU/ml,HBeAg阳性。其余未干预组二胎孕妇病毒量均较低,其婴幼儿均未被感染。干预组其婴幼儿检测HBsAg,HBeAg及HBV DNA均阴性,HBV母婴传播感染率为零,HBV母婴阻断率为100%。而且有不同程度的乙型肝炎保护性抗体出现,其抗体滴度高于非干预组及对照组孕妇所生婴幼儿,差异有统计学意义(F=5.95,P<0.001),与其孕妇既往感染HBV时间,孕周及分娩方式,新生儿出生Apgar评分,出生体重,喂养方式,性别等无统计学差别,但与孕期抗病毒治疗有明显的统计学差异。第三部分,针对29对发生HBV母婴垂直感染母婴患者,通过二代测序技术,成功从孕妇血标本提取胎儿游离DNA和乙肝病毒DNA及其测序,分析乙肝病毒全基因序列显示,各母子对病毒全基因序列同源性在99.4%至100%,19对母子(占比65.5%)病毒序列完全一致。按不同基因型分别与B2和C2野生型乙肝病毒株序列进行比较,母亲感染的B和C基因型突变株与野生株乙肝病毒均可通过宫内传播,未发现有宫内传播优势的特异突变位点。结论:1.贵州地区乙肝孕妇以B,C基因型为主,以阻断治疗为目的,在不同的基因型孕妇使用替诺福韦(TDF)或替比夫定(LDT)阻断治疗时,均能取得较好的疗效,但在持续抗病毒治疗基础上,B基因型病毒更容易得到控制。孕中晚期使用TDF或LDT治疗除可以控制HBV病毒外,未见明显不良反应,还可调节孕妇机体的T淋巴细胞免疫功能,其机制可能与改善CD4+T细胞亚群重建,继而引起CD8+T细胞增多有关。2.本课题非干预组发生了 HBV母婴传播,发生率为11.19%,母婴传播感染者其母亲分娩前HBV DNA均大于≥ 106 IU/ml,其中,HBeAg阳性15例,HBeAg阴性14例。进一步分析非干预组婴幼儿HBV感染与母亲HBV DNA载量的关系,当母亲HBV DNA≥106IU/ml其母婴传播感染高达38.67%(29/75),提示高载量HBVDNA复制是发生乙型肝炎母婴传播的独立危险因素。3.二代测序技术用于监测HBV基因及其突变,产前无创性诊断HBV宫内传播,为设计精准的及个体化乙肝抗病毒抗病毒方案提供可靠的依据,可能是乙肝母婴传播的产前诊断重要评估技术。因此,针对乙型肝炎高风险孕妇,需产前HBV动态监测及药物干预与产后标准联合免疫阻断,才能从真正临床上实现乙型肝炎母婴零传播。