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研究背景恶性肿瘤严重危害人类的健康,全球每年大约1000多万人死于癌症。尽管目前癌症治疗在手术、放疗、化疗、及分子靶向治疗等多学科综合治疗方面取得了很大进展,但晚期癌症患者的预后仍不理想,迄今仍缺乏十分有效的治疗方法。因此,探索一种新的防治恶性肿瘤的治疗方法尤为重要。随着肿瘤免疫学及分子生物学的发展,通过调动或激发机体自身的免疫功能,从而抑制和杀伤肿瘤细胞的免疫治疗成为恶性肿瘤治疗领域新的热点。嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor T,CAR）T细胞是一种具有靶向性的抗肿瘤免疫疗法,能特异性地识别并杀伤表达靶抗原的癌细胞,还能在体内增殖活化,但对不表达靶抗原的细胞无任何作用。CAR T细胞在血液系统恶性肿瘤中取得了很好效果,靶向CD19的CART细胞在复发难治B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）中的完全缓解率高达90%。Kymriah、Yescarta是靶向CD19的CART细胞,已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准,分别用于治疗B-ALL和弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。虽然CART在血液系统肿瘤中取得了很好的疗效,但是在实体肿瘤中的治疗中还面临很多困难。肿瘤浸润淋巴细胞的数量与患者的预后密切相关,增加肿瘤微环境中CAR T细胞的积累对肿瘤的治疗至关重要。为了克服免疫细胞浸润不足的障碍,迫切需要开发新的CART设计。CXCL9可以增加T细胞向肿瘤的迁移浸润,并且可以抑制肿瘤血管生成。因此,我们设计了表达CXCL9的靶向间皮素CART细胞（CARTmeso-CXCL9）,通过细胞模型、动物模型证实了 CARTmeso-CXCL9可以提高CAR T的迁移能力和杀伤肿瘤的功能,从而为实体瘤的治疗提供新的治疗策略。1 CXCL9对T细胞功能的影响目的研究CXCL9对T细胞的迁移、杀伤、分化和血管生成的影响。方法（1）流式细胞术检测T细胞活化前后CXCL9和CXCR3的表达。（2）Transwell实验检测CXCL9对T细胞迁移能力的影响。（3）流式细胞术检测CXCL9对T细胞杀伤、活化、分化的影响。（4）TCGA数据库分析肺癌组织CXCL9的表达和T细胞相关基因的相关性。（5）血管生成实验检测CXCL9对脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）形成血管的影响。结果（1）T细胞活化后CXCR3明显升高。（2）CXCL9增强T细胞迁移能力。（3）CXCL9促进T细胞的功能因子的分泌。（4）CXCL9促进T细胞向Th1的分化。（5）TCGA数据分析结果显示CXCL9的表达与T细胞在肺癌组织中的浸润及T细胞的活化和功能相关。（6）CXCL9减少HUVEC血管生成。结论CXCL9可以增强T细胞迁移能力及杀伤功能。CXCL9在肺癌肿瘤组织中的表达与T细胞的浸润、活化正相关。CXCL9可以抑制血管生成。2 CXCL9对CARTmeso细胞功能的影响目的构建以间皮素（mesothelin,MSLN）为靶点的CARTmeso细胞和过表达趋化因子CXCL9的CARTmeso-CXCL9细胞,验证两种CART细胞对肺癌细胞系的体外杀伤效果。方法（1）免疫组化检测靶抗原MSLN在肺癌组织的表达;流式细胞术检测靶抗原MSLN在肺癌细胞系的表达情况。（2）用慢病毒转染的方法分别构建以MSLN为靶点的CARTmeso细胞和过表达趋化因子CXCL9的CARTmeso-CXCL9细胞。（3）流式细胞术及细胞因子微球检测技术检测CARTmeso和CARTmeso-CXCL9 分泌 CXCL9 的情况。（4）使用流式细胞术及酶联免疫吸附实验检测CARTmeso和CARTmeso-CXCL9对MSLN阳性靶细胞的杀伤效果。（5）Transwell 方法检测 CARTmeso 和 CARTmeso-CXCL9 的招募能力。（6）血管生成实验检测CARTmeso和CARTmeso-CXCL9培养上清对HUVEC血管生成的影响。结果（1）免疫组化结果显示MSLN在肺癌肿瘤组织中高表达;流式细胞术结果显示肺癌细胞系H322高表达MSLN,而A549低表达MSLN。（2）流式细胞结果显示可以成功构建 CARTmeso 细胞和CARTmeso-CXCL9 细胞,CARTmeso-CXCL9 细胞表达 CXCL9 明显增加。（3）流式细胞结果显示,CARTmeso-CXCL9细胞较CARTmeso细胞能更有效杀伤H322肺癌细胞,酶联免疫吸附实验结果显示CARTmeso-CXCL9细胞可以分泌更多效应细胞因子IFN-γ。（4）Transwell 结果显示,CARTmeso-CXCL9 细胞较 CARTmeso 细胞具有更强的招募能力。（5）血管生成实验显示,CARTmeso-CXCL9的培养上清可以抑制血管生成。结论CARTmeso-CXCL9细胞较传统的CARTmeso细胞具有更强的体外杀伤功能、招募能力,并可以抑制血管生成。3 CXCL9对CARTmeso在小鼠异种移植肿瘤模型中抗肿瘤能力的影响目的建立小鼠异种移植模型,研究CXCL9改造的CARTmeso-CXCL9细胞NOD/SCID小鼠肿瘤模型中抗肿瘤的能力。方法（1）小鼠异种移植皮下荷瘤模型检测CXCL9改造的CARTmeso-CXCL9细胞对T细胞的迁移浸润、招募、增殖、分化、杀伤功能的影响。（2）小鼠基质胶栓实验模型检测CXCL9改造的CARTmeso-CXCL9在体内对血管生成的影响。（3）小鼠异种移植荷瘤模型检测CXCL9改造的CARTmeso-CXCL9对小鼠肿瘤进展的控制。结果（1）在小鼠异种移植皮下荷瘤模型中,CXCL9改造的CARTmeso-CXCL9细胞的浸润能力更强,可以招募内源性T细胞,促进T细胞向Th1分化,增加功能性细胞因子的分泌。（2）在小鼠基质胶栓实验模型中,CXCL9改造的CARTmeso-CXCL9细胞可以抑制血管生成。（3）在小鼠异种移植皮下荷瘤模型中,CXCL9改造的CARTmeso-CXCL9可以显著抑制肿瘤生长。结论在小鼠肿瘤模型中,CXCL9改造的CARTmeso-CXCL9具有更强的迁移浸润、招募、杀伤、抗血管生成的能力,具有更强的抗肿瘤能力。