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目的:综合评价骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)对致敏小鼠造血干/祖细胞移植植入的影响,先后进行了一系列研究:包括首先对致敏小鼠骨髓MSC进行体外培养后的形态学及功能评估,随后是正常小鼠骨髓MSC在致敏小鼠体内的归巢示踪实验,以及小鼠MSC/MSC培养上清液对致敏小鼠脾淋巴细胞的增殖影响的体外实验,最后是利用不同组合的MSC联合造血干/祖细胞移植,观察MSC对致敏小鼠造血干/祖细胞移植中移入的影响的动物体内实验。
方法:应用贴壁培养法进行体外致敏/正常小鼠骨髓间充质干细胞培养,形态学观察并利用流式法检测培养细胞表面标志,同时进行成骨,成脂,成肌多向分化能力的检测,全面对致敏和正常小鼠骨髓MSC的形态功能进行对比评估;随后应用绿色荧光颜料(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺,CSFE)体外标志正常小鼠骨髓MSC后,经尾静脉注射到致敏小鼠体内,分别利用冰冻切片及流式检测法检测在注射后6小时,24小时及48小时各主要脏器(包括外周血,肝脾,骨髓,肺及肾等)标志了荧光颜料的细胞分布情况,借此了解MSC在致敏小鼠体内归巢情况;最后进行MSC对致敏小鼠造血干/祖细胞移植植入的影响实验,具体包括体外实验:应用MTT法检测混合淋巴细胞反应,了解MSC/MSC培养上清液对致敏小鼠脾淋巴细胞增殖的影响;以及体内实验部分:不同组合的MSC干预设计,联合致敏动物的异基因造血干/祖细胞移植,在移植后进行了相关观察,其中包括生存分析,移植效果分析(包括血象改变,免疫功能的重建检测,骨髓细胞恢复及嵌合分析等)和移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)观察,以便全面了解MSC对致敏动物异基因造血干/祖细胞移植植入的影响。
结果:致敏小鼠骨髓MSC与正常小鼠MSC比较,形态学及功能方面未见明显异常;体外正常小鼠骨髓MSC经尾静脉注射进入到致敏动物体内后很快并持久地在致敏小鼠的肝脾等网状内皮系统聚集;体外实验表明,正常小鼠骨髓MSC在体外能很好地抑制致敏小鼠脾淋巴细胞增殖,同时MSC培养上清液也能观察到类似现象;但在体内实验中,在本课题设计下的MSC联合应用异基因造血干/祖细胞移植未能促进2次异基因脾细胞注射的致敏动物模型的异基因骨髓造血干/祖细胞移植的植入,未能延长致敏动物移植后的生存时间。
结论:利用异基因脾细胞注射方式致敏的小鼠,其骨髓MSC与正常小鼠的比较未见明显异常。外源性MSC能经尾静脉注射方式很快并持久地在致敏小鼠体内引起致敏反应的内皮网状系统如肝脾等靶器官聚集。MSC能在体外明显抑制致敏小鼠脾淋巴细胞增殖,该作用可以通过细胞与细胞接触抑制,也可通过细胞因子发挥作用。但在体内实验中应用1×106MSC在不同组合下联合异基因骨髓造血干/祖细胞移植,未能促进2次利用异基因1×106C57BL/6脾细胞致敏的BALB/c小鼠异基因造血干/祖细胞移植的植入。