杆状病毒是节肢动物,特别是鳞翅目昆虫重要的病原微生物。近年来,发展而成的杆状病毒表达系统、重组杆状病毒杀虫剂、杆状病毒基因治疗载体和杆状病毒表面展示系统为科学研究作出了巨大的贡献。到目前为止,已有28种杆状病毒,包括21种核型多角体病毒和7种颗粒体病毒的基因组全序列被测定。对基因组全序列分析发现,有30个基因是杆状病毒的核心基因,参与了病毒的复制、转录、组成等各方面,其中部分基因功能至今没有研究报道。本论文选择了家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)ORF79、ORF118、ORF56三个功能未知的杆状病毒核心基因为研究对象,对基因转录、表达、亚细胞定位、病毒结构定位、基因缺失进行了分析,从而为丰富杆状病毒分子生物学提供理论基础。本论文主要结论如下: 1.Bm79基因分析 Bm79基因位于BmNPV(T3株)基因组76132-76680nt,全长549bp,编码一个含182个氨基酸残基的蛋白,预测分子量约为20.9kDa,在其N端有一个由22个氨基酸残基组成的信号肽。在Bm79基因ATG上游存在杆状病毒晚期转录基序TTAAG,在终止密码子TAA下游发现转录终止信号AATAAA。 Northern blot分析发现,Bm79在病毒感染宿主细胞12h(h p.i.)开始转录,在72hp.i.丰度达到最高,96hp.i.时开始衰退。利用大肠杆菌表达系统表达了Bm79融合蛋白并制备了多克隆抗血清。利用抗血清进行Western blot分析,发现Bm79基因产物在病毒感染宿主细胞后24h被检测出来,并一直持续到72hp.i.。以上数据说明Bm79是一个晚期表达基因,这一点也经DNA合成抑制剂(阿胞糖苷)试验得到证实。 Western blot分析Bm79基因产物也发现,检测到的Bm79蛋白分子量为28kDa,比预计值大了8kDa,说明Bm79基因产物可能存在翻译后加工修饰。虽然Bm79氨基酸序列中存在多个N-糖基化位点,但用N-糖蛋白抑制剂(衣霉素)进行处理试验结果显示,Bm79并不是一个N-糖蛋白,说明存在着其它蛋白翻译后修饰方式。 用Westem blot和免疫金标记-透射电镜分析,对Bm79的病毒结构定位进行了观察。利用Western blot方法检测分离出的BmNPV ODV囊膜蛋白、ODV核衣壳蛋白和BV粒子各组分,结果表明Bm79特异存在于ODV囊膜蛋白上。采用低温包埋、免疫金标记-透射电镜方法处理BmNPV多角体颗粒,发现Bm79抗血清结合的金颗粒结合在ODV杆状相关蛋白上。另外,利用间接免疫荧光对Bm79的亚细胞定位进行了观察,发现Bm79分布在感染细胞的细胞核内,这与它作为囊膜蛋白的特性是相符的。