实验目的：　　Legumain高表达是RB（Retinoblatoma,视网膜母细胞瘤）及其微环境的重要特征之一。基于此，我们设计和构建 legumain酶响应的DOX（Doxorubicin，阿霉素）纳米药物控释载体，并对其进行表征、优化，确定其体内外释放规律及其对癌细胞的抑制效果，以获得一种理想的有效抑制视网膜母细胞瘤的药物载体。　　实验方法：　　通过玻璃体腔注射Y79悬浮细胞液（Y79是一种较成熟的人类RB细胞株，源自于视网膜内丛状层肿瘤，具有视网膜细胞的特性）制备RB动物模型。使用Trizol试剂和RIPA裂解液分别从Y79细胞、ARPE细胞（Adult Retinal Pigment Epithelium, ARPE,是一种广泛使用的人源视网膜细胞系）和 RB实体瘤提取mRNA和蛋白。通过实时荧光定量PCR法和Western blot检测Legumain蛋白酶在Y79、ARPE以及RB实体瘤中的表达水平。结果表明Legumain在Y79和RB实体瘤中的表达水平远高于在ARPE中的表达水平，为后续Legumain响应药物载体设计奠定基础。　　在此项研究中，我们首先设计和合成一种 Legumain蛋白酶活化胶束，以Legumain的底物肽（PEP）将亲水性聚乙二醇和疏水性聚谷氨酸苄酯（PBG）桥接来递送DOX。我们推测该胶束将在高Legumain活性位点活化释放，从而增加DOX的靶向性和抗癌活性。通过核磁共振氢谱（1H-NMR, Varian, USA）和傅里叶转换红外光谱仪（FT-IR, NICOLET6700, USA）确定共聚物的化学结构，凝胶渗透色谱系统（GPC, Malvern, UK）测定其分子量，高效液相色谱法（HPLC， Agilent, USA）检测DOX的包封率和包载率。动态光散射（DLS，Malven, UK）测量粒径及其稳定性。接着通过透析法使两亲共聚物自组装形成胶束。高分辨率透射电子显微镜观察胶束的形貌。使用游离DOX和包载DOX的胶束处理Y79和RPE细胞（Retinal Pigment Epithelium，RPE，视网膜色素上皮细胞）并测定其细胞毒性。使用荧光显微镜和流式细胞仪(Partec, German)进一步表征游离DOX与包载DOX的胶束的细胞摄取量。　　为了改善药物释放的可控性，根据 RB高表达 Legumain的特性，DOX与Legumain底物肽（PEP）缀合形成 DOX-PEP，再进一步与琥珀酸苷反应,在末端添加一个羧基（DOX-PEP-COOH）。DOX-PEP-COOH嫁接到壳聚糖骨架结构形成CS-PEP-DOX，在微乳液体系中与京尼平交联形成纳米颗粒。通过物理作用将姜黄素（Curcumin, CUR耐药蛋白抑制剂）包载到纳米颗粒的核心形成共包载体系（CS-PEP-DOX/CUR）以进一步提高其抗癌效果。经 MS、FT-IR、DLS、SEM（Phenom-World，The Netherlands）表征和分析中间产物和终产物的分子量、化学结构、粒径分布和表面形貌。CCK-8法（CCK-8, Dojindo, Japan）测定游离药物和包封药物的细胞毒性作用，以处理细胞和未处理细胞吸光度百分比计算细胞存活率。由于缺少成熟的耐药型 RB细胞系，我们采用公认的耐药细胞模型（MCF-7/ADR）来评价CS-PEP-DOX/CUR纳米颗粒逆转耐药的效果。在体实验中，25只3-4周龄的雌性裸鼠多耐药肿瘤模型构建成功。选取其中18只裸鼠随机分为3组（即A、B、C组），每组6只。在造模后8w左右，当观察到有肿瘤形成并可用游标卡尺测量时，A组、B组、C组分别通过腹腔注射250μL共包载悬浮液（阿霉素浓度为60μg/ml，姜黄素浓度为100μg/ml），等量的游离阿霉素和游离姜黄素混合液和 PBS平衡盐溶液。每周测量和记录肿瘤大小。使用以下等式计算肿瘤体积（mm3）:V=a×b2/2（其中a和b分别代表最长和最短直径）。取荷瘤裸鼠4只，随机再分为两组，分别腹腔注射250μL Cy5.5荧光探针标记的CS-PEP-DOX/CUR悬浮液和250μL Cy5.5荧光探针标记的DOX和姜黄素的混合溶液。Maestro2体内成像系统在激发波长为670 nm处观察评估肿瘤靶向性，近红外荧光发射强度为710 nm处的间隔时间内拍照记录。　　实验结果：　　荧光定量PCR研究表明，Legumain在视网膜母细胞瘤细胞Y79和正常视网膜上皮细胞ARPE均有表达，且在Y79中表达量是ARPE的6-8倍。Western blot实验表明在RB实体瘤中Legumain蛋白含量显著高于ARPE。　　设计合成Legmain响应两亲嵌段共聚物，通过1H-NMR和FT-IR分析，结果表明该两亲共聚物已经成功合成。进一步用透析法自组装包载DOX形成球形纳米胶束，直径约为100 nm。该纳米胶束中DOX的释放速度受Legumain调配，且与Legumain浓度呈正相关关系。纳米胶束显著提高了Y79对DOX的细胞摄取量，并且增加了DOX对肿瘤的细胞毒性，同时降低了其对RPE的细胞毒性。表明该载体可作为Legumain高表达肿瘤的药物载体。　　为了增加药物释放的可控性，我们进一步设计制备了Legumain响应的化学键合包载的药物载体。我们首先合成了DOX多肽（Legumain底物多肽）衍生物（DOX-PEP）。核磁共振、红外以及质谱数据表明我们已经成功合成了DOX-PEP。我们将DOX-PEP进一步嫁接至壳聚糖（Chitosan, CS）上，优化反应参数，考察不同催化体系对嫁接效率的影响。结果表明，EDC/DMAP催化得到较高的催化效果。在微乳化的溶剂体系中交联形成粒径约为400 nm，带正电的非球形纳米粒子。该纳米药物（CS-PEP-DOX纳米药物）能够显著增加DOX对Y79的抑制效率。为了进一步提高DOX的抗癌效率，我们将CUR（Curcumin，CUR,姜黄素）进一步包载到 CS-PEP-DOX纳米药物疏水核心，形成共包载药物体系（CS-PEP-DOX/CUR纳米药物）。研究CS-PEP-DOX/CUR纳米药物逆转肿瘤多耐药性的效果。结果表明，CUR能够显著增加 Y79细胞对 DOX的敏感性。CS-PEP-DOX纳米粒子对Y79的抑制率从游离DOX的5％提高到25%。共包载CUR后对Y79的抑制率进一步调高到35%。由于Y79并非耐药细胞模型，我们进一步用成熟的耐药型细胞系 MCF-7/ADR进一步评价 CS-PEP-DOX/CUR纳米药物逆转多耐药性的效果，结果显示1.8μg/mL DOX处理浓度下， CS-PEP-DOX纳米粒子对MCF-7/ADR的抑制率从游离DOX的5%提高到35%。共包载CS-PEP-DOX/CUR进一步提高药物的处理效果，对MCF-7/ADR的抑制率进一步调高到57%。我们制备了裸鼠肿瘤模型用于评价CS-PEP-DOX/CUR纳米药物的治疗效果。结果表明CS-PEP-DOX/CUR纳米药物能够显著抑制肿瘤生长的效果，表现出较好的治疗效果。　　实验结论：　　本研究设计合成了Legumain响应的两亲共聚物，自组装包载DOX形成的纳米胶束（疏水相互作用载药）。该药物载体能够促进Y79对DOX的吸收，增强 DOX对 Y79的抑制效果。同时，本研究进一步设计制备了基于壳聚糖的Legumain响应DOX载体（化学键合载药），结果表明该纳米药物能够显著增加DOX对Y79的抑制效果。为了使药物载体具有逆转多耐药性的效果，我们将CUR（耐药蛋白抑制剂）共包载形成CS-PEP-DOX/CUR纳米颗粒。该载体能够进一步增加 DOX对 Y79的处理效果。同时，相比 CS-PEP-DOX纳米颗粒， CS-PEP-DOX/CUR纳米颗粒能显著增强对耐药型肿瘤的抑制效率（细胞水平和动物水平），表现出逆转多耐药性的效果。本研究为寻找 RB新的药物处理方法提供参考。