四氢嘧啶是细菌、真菌和一些古细菌中广泛合成的,用来应对高盐度、高渗透压和极端生长温度的相容性溶质。四氢嘧啶因其具有优良的抗逆保护特性在生物技术,皮肤护理和医学中具有广泛的应用潜力。盐单胞菌Halomonas hydrothermalis Y2是一株分离自造纸废液,在废液中高盐强碱的环境下占据生存优势的菌株。基于实验室前期对H.hydrothermalis Y2的在三个不同pH（pH6,pH8,pH10）下的转录组数据分析,筛选获得15个可能的强组成型启动子。通过启动子探针载体测定启动子活力,识别出一个强组成型启动子P2155,每毫克蛋白的酶活达到了 5200 U,是对照组酶活的80倍。进一步通过截短实验确定了 40 bp的P2155核心区域。通过5’RACE对四氢嘧啶合成通路ectABC的转录起始位点进行分析,结合对-10区和-35区序列的分析确定启动子类型,盐敏感性实验表明H.hydrothermalis Y2中ectA的启动子为盐敏感性启动子,而ectB的启动子以及H.salinas DSM5928T中ectA的启动子不具有盐敏感性。为缓解来自发酵罐、下游加工设备和废水处理的压力,降低四氢嘧啶合成过程中的盐依赖性,用H.hydrothermalis Y2外膜孔蛋白Porin中的启动子P2155取代ectA启动子。不同盐浓度下的摇瓶实验发现,替换启动子显著降低了四氢嘧啶合成的盐依赖性,启动子替换后的菌株,胞外四氢嘧啶的合成能力明显增强,低盐条件下尤为明显。在1L发酵罐中的72h流加发酵的数据也显示,当盐浓度为80 g L-1时,Y2/p/△ectD/△doeA的四氢嘧啶产量为13.1 g L-1,提高了 13%。同理,本研究还采用四氢嘧啶分泌型菌株H.salinas DSM5928T的ectA启动子来替换H.hydrothermalis Y2中的ectA前启动子,得到了相似的结果。为降低发酵后期四氢嘧啶的降解,对四氢嘧啶吸收相关通路TeaABCD进行分析,并且敲除了底物结合蛋白TeaA,使该通路丧失功能。敲除之后的菌株Y2/p/△ectD/△doeA/△teaA的四氢嘧啶产量有了一定提高,分批发酵产量为4.1 g L-1,流加发酵产量为14.4 g L-1,最适盐浓度为60 g L-1。四氢嘧啶是一种保护剂和稳定剂,其合成途径仅存在于某些中度嗜盐菌中。但是在这些菌株中,四氢嘧啶的高产往往依赖于高盐的环境。因此,本文初步尝试将四氢嘧啶合成途径引入谷氨酸棒杆菌,构建四氢嘧啶的异源生产菌株。选择高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌生产菌株Corynebacterium glutamate Lys作为出发菌株,为弱化竞争性赖氨酸分支,提高四氢嘧啶产量,构建基因组上的赖氨酸外排基因敲除菌株。在此基础上将来自H.hydrothermials Y2的ectABC基因簇导入谷氨酸棒杆菌C.glutamicum Lys中,构建获得ECT-1菌株。初步进行摇瓶发酵验证,结果表明该菌株具有了一定的四氢嘧啶合成能力（3.7 g L-1）,显示了进一步优化改造的潜力。