不同临床状态COVID-19患者免疫状况差异研究及SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体制备

来源 :军事科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qqq1234qqqqqqq
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
研究背景:严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2,简称“新冠病毒”)是新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19,简称“新冠肺炎”)的病原体,自2019年底被发现以来,快速在全球传播,截止到2022年6月,已经感染了超过5亿人,导致了600多万人死亡,引发了严重的公共卫生问题。随着SARS-CoV-2病毒的快速播散,SARS-CoV-2变异株不断涌现,流行态势愈发严峻。COVID-19患者在感染后呈现出不同的疾病状态,多数人表现为发热、咳嗽相关的轻度或中度症状,少量人则发展为急性呼吸窘迫综合征、急性心脏损伤、多器官衰竭和继发性感染,产生严重的不可逆损伤,呈现出临床重症状态。加强COVID-19重症发生机制研究对于有效的减少重症发生至关重要,也是疫情防控成功与否的关键。研究显示,COVID-19重症患者会出现严重的细胞因子风暴,说明重症发生与患者免疫状态密切相关。深入分析COVID-19患者体内的免疫状态,特别是重症患者的体内免疫状态,对于阐明COVID-19患者重症发生机制、防止重症发生以及减少SARS-CoV-2流行有重要意义。研究目的:收集不同临床状态的COVID-19患者信息及相关样本,比较普通型和重型患者体内抗体、细胞因子分布差异,确定不同患者体内抗体分型差异,阐明不同患者体内抗体对不同SARS-CoV-2变异株的中和状况,分析COVID-19患者体内抗体和细胞因子改变的内在机制,并利用B细胞永生化技术制备SARS-CoV-2 N蛋白单克隆结合抗体,为COVID-19的诊断、治疗、防控等提供支撑。研究方法:(1)样本收集:根据我国《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》招募不同临床分型的COVID-19患者、健康人对照和新冠病毒疫苗接种者,签署知情同意书后由专业访谈人员调查流行病学信息,并收集外周血样本。(2)抗体滴度检测和分型鉴定:使用野生型SARS-CoV-2活病毒(Beta CoV/Beijing/AMMS01/2020)和9种假病毒,利用有限稀释法观察细胞病变效应或检测荧光值获得研究对象血浆抗体的中和滴度,采用抗N蛋白和S蛋白IgG抗体ELISA定量检测试剂盒检测不同研究对象外周血中结合抗体水平,利用抗IgA、IgM、IgG1~4、IgD、IgE的二抗检测COVID-19患者和疫苗接种者体内抗N蛋白和S蛋白抗体分型。(3)细菌、真菌感染检测:通过ELISA检测COVID-19患者和健康人样本中BDG、LPS、iFABP、GP73含量,从而系统性分析COVID-19患者的免疫特征。(4)细胞因子检测:使用Ella-Simple ELISA系统和Luminex系统检测COVID-19患者和健康人样本中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-18、IL-33、CCL2、CCL3、CCL4、CXCL1、CXCL2、CXCL6、CXCL9、CXCL10、IFN-γ、TNF-α的含量。(5)COVID-19患者中HERV-K与IFN的相关性:采用q PCR方法检测Vero E6细胞感染SARS-CoV-2后HERV-K gag、env、pol基因和IFN相关基因IFNB1、ISG15、IFIT1的转录水平变化,并在COVID-19患者的外周血细胞中进行验证,利用二代测序技术和GO分析明确SARS-CoV-2感染后HERV-K基因转录水平。(6)B细胞永生化技术抗体制备:从COVID-19患者外周血中分离获得PBMC,用EB病毒感染PBMC使B细胞永生化,经过多轮克隆化和抗体结合特异性分析鉴定SARS-CoV-2 N蛋白和S蛋白特异性结合抗体,提取该细胞株RNA并反转录后扩增抗体轻重链可变区序列,构建抗体表达载体,转染293F细胞,收集上清并用protein A/G柱纯化抗体,进行抗体特异性和亲和力分析。研究结果:(1)共招募82例COVID-19患者、29例疫苗接种者和32例健康对照。根据临床症状,患者包括轻型患者1例、普通型患者49例、重型患者30例和2例危重型患者,其中普通型患者和重型患者的性别构成、平均年龄、疾病史占比没有统计学差异。(2)使用野生型SARS-CoV-2病毒检测的中和抗体结果显示,重型患者体内中和抗体滴度、血浆IgG-S和IgG-N抗体浓度显著高于普通型患者(P<0.05),COVID-19普通型患者IgG-N含量为IgG-S的13.30倍,重型患者IgG-N抗体含量为IgG-S抗体的16.72倍(P<0.05)。普通型和重型COVID-19患者血浆IgG-S抗体水平与中和抗体滴度均呈正相关(P<0.05)。(3)抗体分型结果表明,普通型和重型COVID-19患者抗N蛋白抗体阳性率为IgA>IgM>IgG,抗S蛋白抗体阳性率为IgG>IgA>IgM。COVID-19患者的IgA-S、IgA-N、IgM-N抗体全为阳性,只有2例重型患者的IgM-S为阴性,所有COVID-19患者血浆中没有检测到特异性IgE阳性抗体。COVID-19患者IgG3-S抗体阳性率高于IgG3-N(P<0.05),IgG4-N抗体阳性率高于IgG4-S抗体(P<0.05)。在COVID-19患者中IgG4-N抗体阳性率为67.01%,而SARS-CoV-2疫苗接种者的IgG4-N抗体全为阴性。(4)Mann-Whitney检验结果显示,普通型和重型COVID-19患者的i FABP低于健康人(P<0.05),而BDG、LSP、GP73高于健康对照组(P<0.05),即COVID-19患者有细菌、真菌感染无肠道菌群异位。(5)Mann-Whitney检验结果显示,普通型和重型COVID-19患者的IL-1β、IL-2、CXCL1、CXCL6低于健康人(P<0.05),而IL-4、IL-6、CCL2、CCL4、IFN-γ、TNF-α含量均高于健康对照组(P<0.05),其中重型患者IL-1β、IL-6、CXCL9水平明显高于普通型患者(P<0.05)。(6)使用SARS-CoV-2活毒和Wuhan假病毒分别检测COVID-19患者的血浆中和抗体滴度,发现两者检测结果相关性高(r=0.9716,P<0.05)。感染Wuhan株的COVID-19患者血浆对Beta、Gamma、Kappa、Delta、Lambda、Omicron假病毒的中和能力低于Wuhan毒株,分别下降5.30倍、3.38倍、3.11倍、2.31倍、4.02倍、32.32倍(P<0.05)。(7)经Mann-Whitney检验,HERV-K gag、env、pol三个基因和IFN相关基因IFNB1、ISG15、IFIT1在COVID-19患者和感染SARS-CoV-2的Vero E6细胞中表达增加(P<0.05),GO分析表明HERV-K与IFN的分泌有关。(8)获得12个来自于COVID-19患者B细胞的永生化细胞系,扩增测序获得2对抗SARS-CoV-2 N蛋白的抗体轻重链可变区序列,体外高效表达、纯化了抗SARS-CoV-2 N蛋白抗体,2个抗体动力学常数KD分别为1.42×10-8 M和1.31×10-8M。研究结论:(1)COVID-19患者感染后血浆中抗体和细胞因子水平明显变化,且重型患者中免疫因子失衡现象更为常见,表明免疫反应失衡可能是重症患者的内在机制,深入分析COVID-19患者的免疫特征对于防止重症发生、减少SARS-CoV-2流行具有重要意义。(2)疫苗接种者和SARS-CoV-2感染者体内抗体分型存在明显差异,提示疫苗免疫和天然感染免疫诱导机制存在差异,SARS-CoV-2特异性抗体分型检测有可能用于新近感染及疫苗接种者甄别。(3)感染武汉株的COVID-19患者血浆对8种全球流行的SARS-CoV-2变异株的中和力降低,且新出现的突变株免疫逃逸能力更强,提示抗SARS-CoV-2疫苗设计和研发应进一步增加针对性。(4)COVID-19患者中高转录水平的HERV-K基因可能参与了激活IFN的c GAS-STING通路,这为进一步研究SARS-CoV-2病毒感染过程中的天然免疫产生机制研究提供了切入点。(5)成功制备了抗SARS-CoV-2 N蛋白的特异性人源化单克隆抗体,说明通过永生化患者体内B细胞可以实现抗体的快速制备,该技术的应用为未来可能出现的新发病原体防控提供了技术支撑。
其他文献
由于川中高磨地区灯影组超深层碳酸盐储层横向非均质性强、缝洞较发育、地震分辨率低、优质储层地球物理特征认识不清等突出问题,造成了储层预测不准、探井工艺井储层钻遇率不高等难题,影响勘探评价效果。通过研究超深碳酸盐优质储层及致密层的地震响应特征,以导眼井电测声波数据为基础,构造不同的地质模型,正演不同地质条件下的合成地震记录,总结出不同地质组合关系下的储层地震响应记录,并与实际地震记录比对分析,确定优质
在全球化程度不断加深的当今社会,引导中国特色民俗文化走向世界已成为时代赋予应用类翻译人员的新任务。刘三姐作为广西壮族自治区最具民族代表性和艺术感染力的文化符号之一,不仅在国内家喻户晓,而且享誉海外,具有广泛的影响力。本文以功能翻译理论为视角,通过案例分析研究了广西刘三姐民俗文化旅游资料,并深入挖掘了刘三姐的文化内涵和文化价值,以加强刘三姐文化和旅游品牌建设,这对传承创新八桂民族文化、促进文化旅游融
本文将集聚理论与匹配理论整合在一个框架内,深入劳动力技能匹配这一微观视角,考察劳动力市场厚度对城市生产率的影响效应以及劳动力市场厚度通过影响技能匹配导致城市生产率变动的传导机制。本文将中国工业企业数据与地级市数据对接,以就业密度、工业企业数量以及产业多样化三个指标度量劳动力市场厚度,运用技能匹配函数估算技能匹配率。实证研究发现,随着劳动力市场变“厚”,城市生产率随之提高;劳动力市场厚度通过提升技能
从电子档案单套管理的必要性、必然性和可行性角度论证,结合国家层面电子档案单套管理实施情况,提出电子档案单套管理的实现路径,旨在为航空装备维修企业探索建设航修电子档案单套管理提供思路和方向。
川中德阳—安岳古裂陷槽东侧磨溪—高石梯地区灯影组已建成以台缘带为主、台地内为辅的大规模天然气生产基地,而同期德阳—安岳古裂陷槽内灯影组遭受更强烈岩溶作用,灯影组残丘型储层发育,且距离寒武系筇竹寺组优质烃源岩更近,具备形成大型天然气藏的潜力。结合前期勘探认识,精细研究了川中德阳—安岳古裂陷槽灯影组残丘型储层特征、形成过程和成藏条件。结果表明:(1)古裂陷槽内灯二段遭受强烈的表生溶蚀和河流深切侵蚀作用
黔东南是少数民族自治州,以苗、侗族人口居多。民俗文化是黔东南各种旅游资源的优势体,民族文化旅游资源在黔东南旅游业发展中,数量占绝对主导,质量具有世界级优势,在景区招揽游客中扮演主要吸引体,是将黔东南打造为“原生态民族文化世界旅游目的地”的基本要素。
自加入WTO以来,外部环境变得更加开放,企业被卷入激烈的市场竞争中,怎样才能在处处充满危机的市场中占得一隅之地,成为企业急需解决的重大课题。而企业竞争归根结底是人才的竞争,人才是促使企业发展和社会进步的源动力,尤其是核心技术人员,是企业的核心竞争力的关键要素,对企业发展起着决定性的作用。本文以YB公司为例,在介绍核心技术人员人力资源管理相关概念和理论的前提下,通过实践调查发现YB公司核心技术人员人
知识生产转型突破了传统学科知识生产框架,一流专业建设应在需求引领下实现变革。试对劳动与社会保障专业分类发展、特色发展方案进行探讨,针对财经类应用型本科高校展开具体的论述。劳动与社会保障专业建设类型可以分为三大类,财经类应用型本科高校一流专业培养需要坚持三原则,通过儒商精神与立德树人相结合、校政融合与校企融合相结合、深度培养与广博培养相结合等策略实现一流专业建设。
人力资源是构成酒店有效管理机制的一种重要影响因素,直接影响酒店企业的运营服务以及管理活动质量。通过设立一套科学合理规范的人力资源激励机制,能够使酒店业最大限度地激发广大员工的工作积极性,提升酒店整体人力资源管理运作成效。基于此,本文就完善酒店餐饮业人力资源管理途径进行探究,以期能够促进酒店餐饮业的健康发展。
目的:采用Apriori算法与系统聚类的数据挖掘技术对中药治疗克罗恩病的用药规律进行分析与总结,为临床治疗克罗恩病提供参考。方法:检索中国期刊全文数据库、万方数据资源系统、维普期刊全文数据库中运用中医方剂治疗克罗恩病的文献,建立数据库,使用Excel、SPSS Modeler 18、SPSS Statistics 21等统计分析软件进行频次、聚类和关联规则分析。结果:共纳入有效文献90篇,提取有效