背景黑色素瘤(melanoma)是一种相对常见的恶性肿瘤,主要累及皮肤及内脏系统。其中以皮肤系统为原发恶性黑色素瘤占所有皮肤癌的2.3%,并且是一种恶性程度最高、最威胁生命的皮肤癌[1,2]。近年来,皮肤癌的发病率逐年上升,其中黑色素瘤的发病率较其他两种皮肤癌上升速度快[3],世界卫生组织(WHO)的数据显示,全世界每年诊断出132,000例新增患者[4],在过去的30年里,尤其是60岁以上的男性及[5]及相对年轻的患者占比较高[6]。研究表明某些黑色素瘤发病与日晒和日光浴有关[7],皮肤白皙,暴露过度的白人有较高的患病风险。此外,约2%的黑色素瘤患者有明确的家族史,与黑色素瘤患者具有血缘关系的亲属患黑色素瘤的风险较其他人增加。黑色素瘤的发生、发展及进化是多种因素共同作用的结果,包括基因突变、遗传、免疫及外界环境等多种因素[9],目前,我们尚未知晓这些复杂的机制。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)基因是最常见的家族性黑色素瘤致病基因,在具有黑色素瘤家族史的患者中阳性率约20%至40%[8]。尽管我们肯定了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、CDK4、TERT、MITF和BAP1等多个基因在黑色素瘤中的发病作用,然而仍然有许许多多的基因在黑色素瘤的发生发展中起着举足轻重的作用。因此,我们有必要明确多个致病基因之间的相关性,确定潜在的分子机制,并寻找重要的生物标志物,有助于黑色素瘤的早期诊断、早期治疗、靶向治疗,为我们的临床提供帮助。几年前,恶性黑色素瘤的治疗手段主要是手术切除。但是,手术治疗仅在黑色素瘤发病早期有效,转移性黑色素瘤尚缺乏有效的治疗方法。令人欣慰的是,近年来新的靶向疗法和免疫疗法的开发取得了重大进展[10],越来越多的药物被研究可用于临床黑色素瘤的治疗:溶瘤免疫疗法、吲哚胺2,3-二加氧酶的选择性抑制剂、抗PD-(L)1等,这无疑给晚期恶性黑色素瘤患者带来了希望,并显著改变了当代肿瘤学的未来发展方向。尽管已经引入了新的治疗方法,并且许多研究证实了它们的有效性,但对于黑色素瘤患者仍然需要更有效、更精准的治疗方法。LIPA基因编码的蛋白质为溶酶体酸性脂肪酶(Lysosomal acid lipase,LAL),LAL是已知的唯一在酸性环境下具有活性的必不可少的细胞内脂肪酶。LAL能水解溶酶体中的胆固醇酯和甘油三酯生成脂肪酸,并且以脂滴的形式储存起来,LAL以组织和细胞特异性方式介导细胞内和细胞外脂质分解代谢。研究显示当癌细胞处于恶劣环境下时会合成脂肪酸(FAs),并通过依赖细胞内及细胞外微环境中的脂肪酸发挥作用从而提高生存力[30，31]。由此可看出,癌细胞具有强大的获取细胞外脂质的能力,并且可以通过细胞内脂质动员和再循环提高肿瘤的生存力。因此脂代谢的调节是治疗癌症中细胞应激的有吸引力的靶标,且LIPA在肿瘤脂代谢方向可能扮演着重要角色。研究目的应用生物信息学方法确定黑色素瘤中起重要作用的致病基因LIPA,通过免疫组织化学、Western blot及PCR实验研究LIPA基因在黑色素瘤中的表达情况,从而评价和明确LIPA蛋白在黑色素瘤中的意义和价值;通过细胞实验进一步阐明LIPA在皮肤黑色素瘤中的表达情况及对皮肤黑色素瘤细胞活性、增殖、迁移能力的影响及生物学作用的机制,从而为黑色素瘤的治疗提供重要的靶点,提高患者的生活质量,为患者带来福音。研究方法1)通过生物信息学分析的方法确定皮肤原发性黑色素瘤中潜在共表达的差异性基因(Differentially expressed genes,DEGs),确定下一步需要研究的目的基因;2)采用免疫组化法分别检测上述25例皮肤恶性黑色素瘤及25例皮肤色素痣患者皮损中LIPA蛋白表达情况,分析LIPA蛋白在皮肤恶性黑色素瘤组织中的表达模式、表达量与临床表型、临床分期的相关性;3)体外培养黑色素瘤细胞、色素痣细胞,采用Western blot、PCR的方法检测体外模型细胞中LIPA的蛋白及基因表达水平;利用质粒的合成、质粒的提取、感受态细胞的制备等技术构建LIPA沉默的细胞模型,再通过利用细胞划痕实验、MTT实验、流式细胞技术检测肿瘤细胞活性、增殖及迁移能力。结果1.通过生物信息学分析了4个基因芯片GSE100050、GSE114445、GSE3189、GSE4587中共同表达的DEGs有256个基因,与正常皮肤组织相比,其中共同过表达的基因有109个,共同低表达的基因有142个,LIPA为过表达基因;2.LIPA蛋白在皮肤恶性黑色素瘤组织中的表达明显高于色素痣组织(P=0.001),差异有统计学意义;3.25例皮肤恶性黑色素瘤组织中。黑色素瘤组织中LIPA蛋白的表达与黑色素瘤患者的年龄、临床分期及发病部位有关。年龄小于60岁患者较60岁以上患者LIPA蛋白表达高、临床诊断为Ⅲ、Ⅳ期患者较Ⅰ、Ⅱ期患者LIPA蛋白表达高、发病部位位于四肢的患者较发病于躯干部位的LIPA蛋白表达较高(P值分别为P=0.023、0.006,0.010),差异有统计学意义。黑色素瘤组织中LIPA蛋白的表达与黑色瘤肿瘤浸润深度、肿瘤大小、临床表型(溃疡型,非溃疡型)、有无再次发作及有无转移无显著相关性(P值分别为P=0.470、1.000、0.250、0.428、0.740,0.350),差异具无统计学意义;4.黑色素瘤细胞A375中LIPA蛋白及mRNA表达量高于色素痣细胞HEM(P值分别为P=0.000、0.000)差异有统计学意义;黑色素瘤细胞MV3中LIPA蛋白及mRNA表达量高于色素痣细胞HEM(P值分别为P=0.000、0.001)差异有统计学意义;5.LIPA-ncRNA、LIPA-shRNA质粒转染黑色素瘤细胞A375、MV3后,与对照组相比,黑色素瘤A375细胞及MV3细胞的增殖能力降低(P值分别为P=0.000、0.000),差异具有统计学意义。6.与色素痣细胞相比,黑色素瘤细胞的活性及迁移能力高于对照组色素痣细胞(P值分别为P=0.000、0.000),差异有统计学意义。结论1.LIPA,BBOX1,CDK1,CPEB3等DEGs在黑色素瘤的发病中起重要作用,其中LIPA、CDK1等为过表达基因;2.LIPA在皮肤黑色素瘤中表达增加,可能与恶性黑色素瘤的年龄、发病部位及临床分期有关。3.抑制黑素瘤细胞中LIPA表达可降低体外黑色素瘤细胞的活性、增殖和迁移能力。