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石斛属是兰科中的第二大属,广泛分布于亚洲、欧洲以及澳大利亚等地,在中国已发现78个种及两个变种,其中部分石斛已被证实具有免疫调节、抗肿瘤以及抗氧化等多种生理活性。目前,在市面上流通较广的可食用石斛属主要包括铁皮石斛及霍山石斛,因其苛刻的生殖要求与生长环境,导致其价格昂贵。兜唇石斛的适应能力较强,人工种植条件简单,对各种病虫害有较强的抵御能力,目前在云南宏德等地大量种植,可见其广阔的市场前景,然而有关兜唇石斛活性成分的研究非常少。为了丰富兜唇石斛的研究内容,提高其应用价值,本文对兜唇石斛中一种免疫活性多糖及抗氧化多肽进行综合研究。首先,使用水提醇沉法从兜唇石斛中提取的粗多糖cDAP得率为38.15±0.20%,使用DEAE Sepharose和Sephadex-G200 Fast Flow对其进行分离纯化得到一种多糖DAP,分子量为471 kDa。经鉴定,DAP主要由甘露糖和葡萄糖组成,摩尔比为2.48:1,其主链是由(1,4)糖苷键连接的β-D-葡萄甘露聚糖。通过小鼠巨噬细胞RAW264.7模型对DAP的免疫活性进行评价,发现DAP能有效提高RAW264.7巨噬细胞细胞因子的分泌水平。此外,DAP能促进巨噬细胞胞饮中性红的能力,在250μg/mL的浓度刺激下,DAP促进的胞饮率最佳。根据抗原-抗体反应原理,发现DAP主要与巨噬细胞膜上complement receptor 3和mannose receptor受体结合,通过刺激巨噬细胞内Akt/mTOR/MAPK和IKK/nuclear factor-?B两个主要免疫调节途径,提高了巨噬细胞的免疫调节能力。通过模拟DAP经唾液、胃肠液的体外消化实验,发现唾液环境对DAP无显著影响,胃肠液环境可引起DAP空间结构的改变,其中肠液环境在一定程度上可改变DAP的一级结构,导致还原糖含量的少量上升。在模拟肠道菌群对DAP的酵解作用时,发现肠道菌群能有效利用DAP产生六种对人体有益的短链脂肪酸,引起pH值的降低。同时选取三种与DAP结构类似的含有(1,4)糖苷键的多糖,包括铁皮石斛多糖和分别来源于大麦和酵母的β-葡聚糖,对其结构进行表征后模拟胃肠消化实验,发现具有较高分子量及较为复杂空间结构的多糖在强酸、高胆盐的胃肠液环境中能有效延缓游离单糖的释放。在对游离单糖进行定量分析时,研究并得到了一种新的用于测定复杂胃肠液环境中微量单糖的检测手段,该手段主要采用7890A/7000 GC-TQ/MS-MS气相色谱技术,可实现对复杂胃肠道溶液中可能存在的微量游离单糖进行准确定量。以兜唇石斛为原料,选用一种乳酸杆菌Lactobacillus amylolyticus对兜唇石斛进行固态发酵,提取并得到了一种兜唇石斛多肽DA-PE。对DA-PE进一步超滤分离,得到4个不同分子量范围的兜唇石斛多肽组分,均含有22种丰富的氨基酸。通过体外抗氧化活性实验,发现DA-PE及超滤后的四种多肽组分具有较强的清除DPPH自由基、清除ABTS自由基的能力以及铁还原力。选取体外抗氧化活性最强的DA-PE小于1kDa的组分(DA-P),对其氨基酸序列进行分析,发现该组分由21种不同排列顺序的短链小分子多肽组成。选取HepG2人肝癌细胞进行CAA assay实验,得到DA-P的EC50值为2.88±0.14 mg/m L,CAA units值为63.46±2.11μM QE/100 g peptides,可见DA-P具有较强的细胞抗氧化活性。选用DA-P进行人红细胞抗氧化实验,发现其对AAPH自由基诱导的红细胞溶血具有较强的保护作用,通过测定人红细胞内与氧化应激有关的指标后发现,DA-P对人红细胞的保护作用主要是通过降低细胞内ROS的含量、减少MDA的产生以及调节抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性有关。同时,使用RAW264.7模型对该DA-P进行免疫学评价,发现DA-P能有效提高RAW264.7巨噬细胞分泌细胞因子NO、IL-6和TNF-α的水平,其中DA-P的浓度与分泌水平呈现正相关。对DA-P进行体外模拟消化实验,发现经胃液、肠液反应后,该组分的体外抗氧化活性增强。随后,对其进行体外模拟肠道菌群的酵解实验,可见DA-P能有效降低酵解体系的pH值,同时促进肠道菌群的生理代谢。采用Caco-2 monolayers小肠上皮细胞吸收模型对DA-P的小肠吸收特性进行表征,对Caco-2 monolayers结构的紧密性进行充分验证后,发现Caco-2细胞对DA-P具有较理想的吸收,AP-BL侧与BL-AP侧的吸收率分别为25.57±0.016%与19.7±0.012%。通过LC-MS/MS分析与游离氨基酸分析,发现DA-P经不同侧吸收后,其游离氨基酸与多肽序列会发生不同程度的变化,说明Caco-2细胞在一定程度上会对吸收的DA-P进行降解和外排。