【摘 要】
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猪传染性胸膜肺炎是一种由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）感染引起的猪的高度传染性的呼吸道疾病,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。目前预防本病的疫苗主要是多价灭活疫苗、亚单位疫苗和基因缺失弱毒疫苗,多价灭活疫苗和亚单位疫苗均对多种血清型菌株的交叉免疫保护率低,弱毒活疫苗可能是提高不同血清型间交叉保护力的解决途径之一。本研究对APP强毒菌株进行
【基金项目】
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公益性行业（农业）科技专项（201303034-11）
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猪传染性胸膜肺炎是一种由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）感染引起的猪的高度传染性的呼吸道疾病,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。目前预防本病的疫苗主要是多价灭活疫苗、亚单位疫苗和基因缺失弱毒疫苗,多价灭活疫苗和亚单位疫苗均对多种血清型菌株的交叉免疫保护率低,弱毒活疫苗可能是提高不同血清型间交叉保护力的解决途径之一。本研究对APP强毒菌株进行了体外连续传代,研究了部分传代菌株的生物学特性和基因组特征,目的是筛选出毒力减弱的APP菌株,并解析其基因突变位点,为弱毒活疫苗的研究提供材料。1.APP菌株的体外传代及传代菌株对小鼠的致病性评价将APP血清型1型菌株JL01-1在体外37°C条件下液体培养至第500代,分别以A37-1—A37-500将传代菌株命名。首先以不同剂量的JL01-1菌液感染昆明鼠,测定JL01-1对小鼠的半数致死量(LD50)为2.76×10~6CFU。挑选了9个传代菌株,用约1-2倍亲本菌株LD50的剂量感染小鼠,通过比较死亡率和肺部组织载菌量,发现37°C传代菌株从120代之后毒力开始减弱。将APP血清型1型菌株JL01-1在体外40°C条件下液体培养至第270代,分别以A40-1—A40-270将传代菌株命名。挑选5个传代菌株,用约1-2倍亲本菌株LD50的剂量感染小鼠,通过比较死亡率和肺部组织载菌量,发现40°C传代菌株毒力较亲本菌有所增强。2.APP传代菌株在体外的生长及抗逆特性为了研究传代菌株在体外的毒力、生长及抗逆特性。本研究挑选传代菌株A37-70、A37-100、A37-119、A37-120、A37-270、A37-320、A37-430和A37-500,检测了其溶血活性、在模拟体内逆境的环境下的生长能力以及这些环境下生物被膜形成的能力。发现传代菌株溶血活性跟亲本菌株比较没有统计学差异。120代之后的传代菌株在常规条件下、高温环境下、厌氧环境下、缺铁环境下的生长能力增强。在低p H环境下,所有传代菌株的生长能力减弱。除了500代菌株之外,传代菌株在37°C、42°C和低p H值环境下生物被膜形成能力减弱。3.传代菌株的比较基因组学分析选取对小鼠致病性减弱以及体外表型实验有变化的传代菌株37-120、A37-270、A37-320、A37-430、A37-500进行了全基因组测序以亲本菌株测序结果为参照,发现传代菌株共发生43个SNP突变、20个缺失突变及35个插入突变,没有大片段的缺失与插入。传代菌株的RNA分子伴侣基因hfq和脂多糖合成基因lpx C＿1基因分别发生了SNP突变和缺失突变,双组分系统相关基因pho P发生了SNP突变,这些基因参与细菌的定植、感染和环境适应性,可能是APP传代菌株毒力下降的原因之一。细胞分裂相关基因fts Z＿1、fts Q、fts A以及细胞壁合成相关基因ddl＿1发生了缺失与插入突变,ddl＿2发生了SNP和插入突变,可能是使得传代菌株生长加快的原因。此外,环境适应相关基因hfq和pho P的突变可能也是生长和生物被膜形成变化的原因。没有发现与溶血相关的毒素基因发生突变,与传代菌株溶血活性的检测结果一致。
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