烧伤是工作和生活中不可避免的意外性伤害之一,我国每年大约有2600万人遭受烧伤。烧伤创面会为细菌感染提供机会,其中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aseruginosa,P.aerauginos)是最严重且最易感染的病原菌之一,会分泌多种毒力因子,极易导致并发症的产生。另一方面当细菌在创面繁殖到一定数量时,会在烧伤面形成克隆,大量细菌聚集在由自身分泌物和胞外基质构成的外膜下,形成生物膜(Biofilm)。伤口在形成生物膜时,细菌会因为胞外基质等外膜的存在产生耐药性,从而降低伤口的愈合速度,加重烧伤患者的痛苦。因此,为了减少伤口处细菌增殖,避免细菌耐药性产生,促进伤口愈合,寻找一种行之有效的抗菌疗法迫在眉睫。光动力抗菌化学疗法(Photodynamic antibacterial chemotherapy,PACT)是近年来发展起来的治疗细菌感染的新方法,其主要通过一定波长的光激发光敏剂产生活性氧对细菌产生杀伤作用。由于活性氧分子在细菌内没有特异性靶点,因而细菌等病原菌对PACT不易产生耐受性,这也是PACT近年来备受关注的主要原因。光敏剂是PACT抗菌研究中的关键因素之一。华卟啉钠(Sinoporphyrin sodium,DVDMS)是我国自主合成的新一代光敏剂,极易溶于水、纯度高、单线态氧产率高。已有研究表明DVDMS有良好的光动力抗肿瘤效果,但关于DVDMS介导的PACT抗菌活性方面研究较少。PACT对革兰氏阳性菌和阴性菌的抗菌能力有一定的差异,这主要是由于两类细菌的细胞壁组成不同所导致。革兰氏阴性菌细胞壁中肽聚糖含量低,光敏剂进入阴性菌细胞内的药物含量有限,从而减弱了 PACT对阴性菌的杀伤作用。为了提高PACT对革兰氏阴性菌的杀伤效果,药物载体系统(如纳米脂质体、纳米粒)被应用于抗菌治疗当中。脂质体(Liposome)作为药物载体已被应用到抗菌治疗中,其中大部分脂质体用于包载抗生素来治疗细菌感染。脂质体作为载体可同时包载疏水和亲水药物,加大了药物对细菌的杀伤能力。阳离子脂质体(Cationic liposome)是表面带有部分正电荷的脂质体,其会通过静电相互作用减少细菌聚集,增加药物在细菌表面的浓度,从而提高抗菌活性。因此,本论文在前期研究的基础上,针对PACT对革兰氏阴性菌治疗的不足,设计载DVDMS阳离子脂质体,通过建立浮游与生物膜状态的铜绿假单胞菌及其耐药菌体系,对载DVDMS阳离子脂质体介导的PACT体外杀伤效应进行了评价;同时建立小鼠皮肤烧伤感染模型,对载DVDMS阳离子脂质体介导的PACT进行在体实验的抗菌效果评估。目前取得的研究结果如下:第一部分载DVDMS普通脂质体与阳离子脂质体的制备与表征研究采用氮吹薄膜水化法分别制备DVDMS普通脂质体(DL)和三种不同比例的DVDMS阳离子脂质体(CDL1、CDL2、CDL3),通过测定粒径、分散系数和电位等对各脂质体进行表征;通过荧光测量法检测合成脂质体的包封率以确定最终所用的阳离子脂质体,并对其单线态氧产量和理化性质进行测定。研究结果表明:采用氮吹薄膜水化法制备脂质体操作简便,结果稳定易重复。四种脂质体粒径在100-130 nm之间,分布均匀,稳定性良好,包封率较高。在综合比较之后确定选用CDL2作为后续实验所用的阳离子脂质体。并且在300-700 nm范围内,CDL2吸收光谱有5个明显吸收峰,最强峰位于408 nm处。在600-700 nm范围内,荧光发射光谱在626 nm处有一个强发射峰,说明脂质体合成后,DVDMS理化性质没有明显改变。第二部分CDL2介导PACT体外抗菌效应及相关机制研究体外实验选用浮游与生物膜状态的铜绿假单胞菌及耐药菌为细菌模型,采用碱裂解法结合流式细胞术研究了 DVDMS、DL、CDL2在细菌中的富集特性;通过菌落计数、SYTO 9/PI染色等探究了 PACT对铜绿假单胞菌的抑菌活性及抗菌机制。研究结果表明:DVDMS、DL、CDL2分别在75、60、15 min时在细菌内富集最多;20-80 μg/ml的DVDMS、DL联合PACT对细菌没有明显杀伤;在0.5-10μg/ml浓度范围内,单独的CDL2对铜绿假单胞菌没有暗毒性,但CDL2-PACT能显著抑制铜绿假单胞菌及耐药菌的增殖;且CDL2-PACT可以诱导ROS水平升高进而使细菌细胞膜通透性增加、DNA受损,从而达到抗菌效果。第三部分CDL2介导PACT对小鼠烧伤感染治疗实验研究建立小鼠皮肤烧伤感染模型,并在伤口处接种铜绿假单胞菌,将小鼠分为对照组、DVDMS-PACT组、DL-PACT组和CDL2-PACT组,连续处理3天,研究治疗第3、7、14 d小鼠皮肤感染处的细菌数量、创面愈合情况、创而愈合率、炎症因子表达、组织切片的H&E染色及小鼠体重变化。结果表明:感染48 h后,模型组小鼠血液中白细胞数量明显增多,证明造模成功;与对照组、DVDMS-PACT组、DL-PACT组相比,CDL2-PACT组的治疗效果最好,创面愈合最快,创面下细菌数量最少,促炎因子表达量最低,证明将DVDMS包载于阳离子脂质体介导PACT可以治疗皮肤烧伤后革兰氏阴性菌感染,促进伤口愈合;同时各组小鼠体重无明显变化,趋于稳定增长状态,组织学观察结果也证明阳离子脂质体联合光动力疗法安全无毒副作用。