恶性肿瘤的靶向治疗及预后相关研究

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本论文以我国常见的恶性肿瘤——非霍奇金淋巴瘤(NHL)及结直肠癌(CRC)为研究对象,从新型染色体结构维持蛋白1(CRM1)抑制剂的体内外抗肿瘤作用机制探索,外周血中预后标志物筛选及靶向治疗相关分子靶点检测几个领域展开研究,内容主要分为两个部分:第一部分:非霍奇金淋巴瘤靶向治疗及预后相关标志物研究本部分研究将通过体外及体内实验验证一种新型CRM1抑制剂KPT-185及KPT-276对NHL的抗肿瘤作用,为将来的临床试验提供理论依据。同时,我们还将检测弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者外周血中一些生物标志物,并对这些标志物的预后价值进行评估,以期得到新的DLBCL预后因子。具体研究内容如下:第一.CRM1抑制剂KPT-185对非霍奇金淋巴瘤的体外抗肿瘤作用研究。本研究检测了新型CRM1抑制剂KPT-185对8种NHL细胞系的增殖、周期及凋亡的影响,并对抗肿瘤作用的分子机制进行探索。结果发现KPT-185对NHL细胞的增殖具有明显的抑制作用,IC50为60-120nM。同时,该抑制剂能够诱导细胞发生G1期阻滞,并引发细胞凋亡。值得注意的是,KPT-185对来源于NHL患者的肿瘤细胞同样具有凋亡诱导作用。对分子机制的探索发现,KPT-185可以通过激活Caspase家族分子杀伤肿瘤细胞。此外,Western Blot的结果显示KPT-185还能够下调与肿瘤增殖、存活相关蛋白,包括:CRM1、NF-κB及Survivin的表达水平,进而发挥抗肿瘤作用。第二.CRM1抑制剂KPT-276体内抗淋巴瘤作用研究。我们通过建立小鼠荷瘤模型对KPT-185类似物KPT-276的体内抗肿瘤活性进行验证。结果显示KPT-276能够明显抑制肿瘤体积增长,延长小鼠的生存期,同时对大体积的肿瘤也具有抑制作用。对药物的毒性作用观察发现,低剂量组中的小鼠未呈现严重的毒副反应。同时,免疫组织化学检测结果显示,KPT-276能够将Survivin蛋白阻滞在细胞核中,这可能是该抑制剂发挥抗肿瘤作用的重要机制之一。第三.弥漫大B细胞淋巴瘤外周血中预后相关标志物研究。我们检测了103例弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者血清中游离轻链(FLC)和总轻链(TLC)浓度,并回顾统计了患者治疗前外周血中淋巴细胞绝对计数(ALC)和单核细胞绝对计数(AMC),分析这些指标与患者生存的关系,评估对DLBCL的预后价值。结果表明血清FLC K和λ轻链同时升高及κ:λ值异常是独立于IPI的预后不良因子(P<0.01)。同时血清中TLC κ和λ轻链同时升高的DLBCL患者总生存期明显缩短(P<0.05),是预后不良的一个指标。对患者治疗前外周血中ALC和AMC与生存的相关性分析发现,ALC≤1.10G/L是DLBCL预后不良的独立因子。以上这些发现将为DLBCL的预后评估提供新的标志。第二部分:结直肠癌靶向治疗相关分子靶点检测本部分研究主要针对结直肠癌靶向治疗耐药相关的KRAS和BRAF基因突变进行检测。首先对检测的方法学进行比较,确立直接测序法的临床应用价值。然后通过大规模病例人群建立中国CRC人群的KRAS和BRAF基因突变频谱,具体研究内容如下:第一.直接测序法和试剂盒法检测结直肠癌KRAS基因状态的比较研究。本实验分别采用直接测序法和ABI公司的KRAS基因突变检测试剂盒对66例CRC组织中KRAS基因突变状态进行检测,比较2种方法检测结果的差异。结果显示,直接测序法与试剂盒法的检测结果一致率为95.5%(Kappa=0.907, P<0.001),虽然直接测序法所需时间较多,但具有明显价格优势,证明该方法在临床实践中检测KRAS基因突变具有广泛应用价值。第二.中国结直肠癌人群中KRAS和BRAF基因突变频谱。利用直接测序法检测674例CRC组织中KRAS基因第12、13和61位密码子以及BRAF基因外显子15和11的突变,并统计分析基因突变率与患者临床病理学特征的相关性。结果显示,KRAS基因突变阳性率为34.4%,其中第12、13及61位密码子突变阳性率分别为25.7%,6.8%及2.1%。BRAF基因的突变阳性率仅为3.1%,其中外显子15的突变率为1.9%,外显子11突变为1.2%。结合临床病理特征分析,KRAS基因在女性患者中的突变率明显高于男性(39.8%vs.30.9%,P=0.020),同时在大于60岁的人群中突变比例明显偏高(39.0%vs.29.9%,P=0.015)。而KRAS和BRAF基因突变与其它病理参数均无相关性(P>0.05)。以上两个研究通过体内及体外实验证实了新型CRM1抑制剂对NHL的抗肿瘤作用,同时筛选得到DLBCL外周血中新型预后标志物。此外,通过对CRC靶向治疗耐药相关基因突变检测方法比较,明确了直接测序法的检测价值,并通过大规模的队列人群研究建立了中国CRC人群中KRAS和BRAF基因突变频谱。以上这些研究结果将为NHL及CRC的靶向治疗及预后提供理论依据。
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