【摘 要】
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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国一种重要的经济鱼类,约占淡水养殖产量的20%,但每年由于病害原因造成大量减产。其中草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)危害最
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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国一种重要的经济鱼类,约占淡水养殖产量的20%,但每年由于病害原因造成大量减产。其中草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)危害最大,被我国农业农村部列为二类动物疫病,开发具有临床价值的环境友好型药物或疫苗对草鱼出血病的防控具有重要意义。本文主要进行了草鱼呼肠孤病毒抑制药物筛选相关的研究,我们试图探究利用与草鱼呼肠孤病毒相互作用的宿主相关蛋白大分子药物能否用于控制不同基因型草鱼呼肠孤病毒感染。1、GcFibulin-4与完整草鱼呼肠孤病毒病毒粒子相互作用的验证及GcFibuli-4多肽片段对草鱼呼肠孤病毒体外增殖复制的抑制效果研究Fibulins蛋白家族是一类由表皮生长因子样结构域(calcium-binding epidermal growth factor-like,cb EGF)及C-末端Fibulin型结构域串联构成的细胞外基质蛋白,其广泛地分布于弹性纤维及脉管系统中。GcFibuli-4为草鱼Fibulin蛋白家族中的成员,有研究发现草鱼的GcFibuli-4蛋白可能与草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白存在相互作用。如果其存在相互作用,那么GcFibuli-4蛋白则很有可能可以作为草鱼呼肠孤病毒吸附感染宿主的中间媒介。我们对GcFibuli-4蛋白是否可与完整的草鱼呼肠孤病毒病毒粒子发生相互作用进行了验证,结果表明其确实可与完整的草鱼呼肠孤病毒病毒粒子发生相互作用,且其能与草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白相互作用的VDNK多肽片段可在一定程度上抑制GcFibuli-4蛋白与完整的草鱼呼肠孤病毒病毒粒子相结合。因此我们利用了VDNK多肽片段来进行草鱼呼肠孤病毒感染抑制实验。结果发现其在50μg/m L以上的用量时即对草鱼呼肠孤病毒体外增殖具有抑制效果。2、肝素钠及硫酸软骨素对草鱼呼肠孤病毒体外增殖的抑制效果研究近年来,有大量研究表明肝素分子能抑制多种病毒的感染。为了揭示肝素分子及其类似物是否也可以阻遏草鱼呼肠孤病毒感染,我们利用I、III型草鱼呼肠孤病毒分别感染草鱼肾细胞系CIK,通过Realtime RT-PCR及Western blot技术分别揭示草鱼呼肠孤病毒感染后细胞上清中的子代病毒扩增效率及细胞内病毒蛋白合成水平,评价了肝素钠及其类似物硫酸软骨素对草鱼呼肠孤病毒感染的抑制效果。结果表明,肝素钠在100μg/m L以上浓度时即对草鱼呼肠孤病毒有抑制效果,10mg/m L以上用量时,病毒蛋白合成效率及上清子代病毒扩增效率均显著降低。其类似物硫酸软骨素相比肝素钠抑制效果有所降低,但在20mg/m L以上用量时,病毒蛋白合成效率及上清子代病毒扩增效率也均有显著降低。研究结果表明肝素钠及其类似物对不同基因型的草鱼呼肠孤病毒的感染具有广谱抑制效应。本研究为开发肝素类药物作为拮抗草鱼出血病的环境友好型药物奠定了初步基础。3、利用稀有鮈鲫感染体系探究多种药物在鱼体水平抗病毒效果稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)是我国所特有的一种小型鱼种,根据相关报道称其对草鱼呼肠孤病毒非常敏感,故我们利用了本实验室分离的II型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-JX02W)对其进行感染,发现其在感染5天后具有明显的出血症状。因此,我们利用了稀有鮈鲫感染体系来探究多种药物在鱼体水平对草鱼呼肠孤病毒的抑制效果。在安全浓度下将氯化铵(50μg/m L)、GcFibuli-4多肽片段(100μg/m L)、肝素钠(20mg/m L)、硫酸软骨素(30mg/m L)等药物分别与II型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-JX02W)混匀孵育,之后采用腹腔注射的方式感染稀有鮈鲫,观察并统计死亡率。结果表明氯化铵能显著减缓草鱼呼肠孤病毒对稀有鮈鲫感染的致死性,GcFibuli-4多肽片段、肝素钠及硫酸软骨素等药物也都不同程度地对草鱼呼肠孤病毒感染稀有鮈鲫有一定的抑制效果。
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