目的:比较不同浓度冷冻保护剂对未成熟大鼠(2周龄)睾丸组织玻璃化冷冻效果的影响,并推荐较适宜的冷冻保护剂方案。初步探索不同浓度保护剂对冻融睾丸组织氧化应激损伤和抗氧化酶系统的影响。方法:使用二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和乙二醇(ethylene glycol,EG)作为主要冷冻保护剂成分配制三种不同浓度的玻璃化冻存液,低、中、高三种浓度冻存液依次命名为A、B、C冻存液:A液中DMSO和EG的浓度均为7.5%,B液均为15%,C液均为25%。两周龄大鼠麻醉后取出睾丸,分割为8mm3～9mm3大小的组织块,分配到新鲜对照组、冻存A组,冻存B组和冻存C组中。经过对应浓度的平衡液处理后,用1ul接种环盛载睾丸组织直接浸入液氮中进行玻璃化冷冻。冻存两周后复苏,样本固定后通过H&E染色比较各组睾丸组织形态学改变,免疫荧光染色比较细胞特异性标志物(UCHL-1,SOX9,StAR)和细胞增殖标志物(PCNA)的表达,TUNEL法检测细胞凋亡。复苏或新鲜的组织体外培养24h后,ELISA法检测睾酮分泌,生化试剂盒比色法检测组织中T-SOD活性和MDA(丙二醛)含量,实时荧光定量PCR检测SOD1,HO-1基因mRNA的表达,免疫印迹法检测HO-1,SOD1蛋白的表达。结果:玻璃化冻存后,未成熟大鼠睾丸组织形态发生一定程度改变,生精细胞及支持细胞标志物表达下降,凋亡增加。三个玻璃化冷冻组中,B组形态学改变最小,细胞标志物表达水平与新鲜对照最接近,凋亡最少。A组的结构损伤明显,生精上皮与基底膜分离;C组的细胞标志物表达明显下降,凋亡增加最显著。冻存后的睾丸组织睾酮分泌水平均有下降,其中C组降低最为明显。T-SOD活性检测结果显示冷冻组织的SOD活性较新鲜组织下降,B组的T-SOD活性相对保存较好;而冷冻组织的MDA含量上升,其中B组含量相对较少,A组含量最多。实时荧光定量PCR结果显示冷冻组SOD1表达较新鲜对照组减少,而HO-1的表达增加。其中B组的SOD1和HO-1 mRNA表达水平均为最高。免疫印迹检测HO-1,SOD1蛋白的表达结果与转录水平的变化趋势基本一致。结论:冷冻保护剂浓度改变对未成熟睾丸组织玻璃化冷冻效果有明显影响。玻璃化冷冻-复苏过程对各类抗氧化酶可能会产生不同影响。15%DMSO和15%EG冻存液方案对于未成熟大鼠睾丸组织玻璃化冷冻较为适宜,可为进一步的实验研究和临床应用提供参考。