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前言 Na+/H+交换体（NHE）是一种将H+排出细胞的同时转入Na+的离子通道，在缺血-再灌注（I/R）损伤中，尤其在心肌缺血期和再灌注早期，NHE的活性对导致细胞内钙超载，进而导致细胞的进一步损伤负有重要的责任。 据一些文献报告，应用NHE阻滞剂抑制NHE的活性，能有效地减轻I/R损伤，发挥强大的心肌保护作用，诸如减少梗塞面积，抗心律失常，改善内皮功能以及减少细胞凋亡等作用。但是NHE阻滞剂的心肌保护作用机制尚不十分清楚；尤其是在再灌注期应用NHE阻滞剂能否发挥心肌保护作用还存在争议，故本研究利用培养的乳鼠心肌细胞进行缺氧/复氧处理，模拟心肌I/R损伤，通过观察单个心肌细胞在缺氧/复氧时细胞胞浆Ca2+浓度(即[Ca2+]i)的动态变化，以及EIPA在不同的时相用药对Ca2+浓度的影响，同时观察细胞面积的变化及细胞存活率，以期阐明EIPA保护心肌细胞，减轻I/R损伤的作用机制。 材料与方法 1．材料 1．1 动物 出生1-2d的Wistar大鼠乳鼠 1．2 药物 5-（N-ethyl-N-isopropyl）-amiloride（EI-PA） 2．方法 2．1 I/R损伤模型的制备 用混合氮气p5％氮气十5％二氧化碳)饱和 30min的台氏（Tyrode’s）液（不含糖）置换瓶中的培养液，达到缺氧的目的，该期观察 180 min。复氧期则换用混合空气”5％空气十5％二氧化碳)饱和的含乃％胎牛血清的DMEM，达到I／R损伤的目的。该期观察70 min。 2．2 实验分组 门)对照组＊ontrol组人在缺就复氧期不予任何药物处理。p)缺氧时给药组（EIPA－I组人除缺氧期的台氏液和复氧期的DMEM中匀含有 14moUL的 EIPA外，余同对照组。c）复氧前给药1组oIPA－R；组X在缺氧开始时不予药物处理，而在缺氧末复氧开始前5 min加人 EIPA（提前5 min加药以便药物能充分发挥其药效作用人使其终浓度为 lpmoUL，复氧时应用的 DMEM中亦含有 lpmoUL的 EIPA。K）复氧前给药 2组（EIPA－R。组人将EIPA－R；组中的EIPA的浓度加大到4pmoVL目可。 3．观察指标 3．l 心肌细胞【Ca卜」；的测定：将已负载 Fur－2的心肌细胞置于倒置荧光显微镜上检测。钙离子荧光的激发波长为340nln／380nm，发射波长为490－slonm。荧光图像由高灵敏度冷CCD数码摄像机采集。荧光信号经Meta－luo专用图像数据分析软件来处理。＊az＊根据 Gynkiewicz提供的公式计算。 3．2 单细胞面积的测定：在应用Meta—flllo分析软件进行图像处理时，采用套锁的方式选取细胞时即可求得细胞的面积。 3．3 心肌细胞存活率 统计学处理：所有测试数据以 X t S表示。经 SPSS．0计算机软件系统进行基本量计算，行方差分析、直线回归分析等。以Pd．05为统计学有意义。 ·2· 实验结果 1．在缺就复氧过程中 EIPA对心肌细胞Ka卜」；的影响：l；I－PAJ组在180mh的缺氧期间里＊／习；上升的幅度很小，与对照组J－R；及担PA－R。组均有显著的差异性。在复氧期间，EIPAJ组和EIPA－Rz组的【Caz＊；上升的幅度明显小于对照组，其间差异有统计学意义，而EIPA－R；与对照组无明显差异。 2．在缺就复氧过程中心肌细胞面积的变化及EIPA对其的影响：对照组的心肌细胞在缺氧30 min后即开始挛缩，面积明显缩小，与EIPAJ组比较有显著差异。EIPAJ组细胞的面积则延迟到90min后才明显缩小。各组心肌细胞在缺就复氧全过程中细胞挛缩程度的比较，EIPAJ组在复氧末细胞缩小K7．63 f12．98）呢，EIPA－R；组为（57，63 S 8．16）％，EIPA－R。组为（5（．皿d．27）％，与对照组门。78。11．38）％比较有显著差异。 3．EIPA对细胞存活率的影响：EIPA－I组的存活率”4．44％)与对照组及mPA－R；组（M．44％和50．00％八比较明显提高，而与EIPA－R。组u1石2％）无显著差异。 讨 论 心肌细胞缺血／再灌注损伤是一系列复杂的反应过程，究其损伤机制目前大多数学者认为是由于细胞内的钙离子超载，氧自由基的产生及细胞粘附分子的参与所引起。其中细胞内钙离子超载又被认为是细胞损伤不可逆发展的共同通路。在细胞缺血／再灌注损伤过程中，电压依赖性地“通道的开放，Na＊ Caz”交换体（NBS）及NHE等的活性共同参与了细胞内钙离子超载。 据部分动物实验研究显示JHE阻滞剂具有许多心肌保护作 ·3·用，如减少梗塞面积、抗心肌顿抑、减少细胞凋亡等等作用，但其保护机制尚不明确；尤其是NHE阻滞剂用于缺血后再灌注时能否达到保护心肌的目的，成为众多学者关注的焦点。 本研究通过培养乳鼠心肌细胞的缺血再灌注损伤实验模型，在心肌细胞缺氧及复氧前行EIPA干预，研究结果表明，在缺氧／复氧全程予以m 厂 厂能显著降低缺氧末及整个复氧期各个时间点的Ca卜的浓度，以及在缺氧期和复氧期Ca＊浓度上升的幅度，有效防止细胞内的钙超