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猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种猪的高度接触性传染病,针对胸膜肺炎放线杆菌血清型众多,现有疫苗缺乏交叉保护力,对规模化养猪业造成巨大经济损失的现状,研究开发具有交叉保护力的新型疫苗迫在眉睫。研究发现Apx毒素是APP的主要保护性抗原,可提高疫苗灭活疫苗的保护作用。天然毒素提取产量低、过程繁琐且成本较高,利用体外克隆表达编码Apx毒素结构蛋白的基因,获得的重组蛋白与天然提取的毒素免疫原性无明显差异,可为下一步新型疫苗多肽成分和ELISA诊断抗原的研究做充分准备。ApxⅣ是近年新发现的一个具有APP种属特异性的抗原,只存在于自然感染的动物体内,不会与其它放线杆菌和革兰氏阴性杆菌发生交叉反应。编码ApxⅣ毒素结构蛋白的apxⅣA基因C端特异性和保守性均很强,是首选的诊断抗原和靶基因。本研究运用蛋白质软件Anthe 5.0分析了APP的两个关键毒力因子ApxⅠA和ApxⅡA的抗原性和亲水性,截取其中主要抗原位点相对集中的核心区域,分别从胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内参考株259和血清7型国内参考株265中扩增了apxⅠA和apxⅡA毒素基因,进行体外克隆,构建了原核表达载体pGEX-4T-1/apxⅠA和pET32a/apxⅡA以及真核表达载体pPICZαA/apxⅠA;并用T4连接酶串连apxⅠA和apxⅡA基因,构建了该融合基因的原核表达载体pGEX-4T-1/apxⅠA-apxⅡA;从胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内参考株259中扩增apxⅣA毒素C端特异和保守的一段基因,进行体外克隆,构建了原核表达载体pGEX-4T-1/apxⅣA。以上四个原核表达载体分别在大肠杆菌DH5α、BL21和Top10’F中以IPTG进行诱导表达,ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅠA-ApxⅡA及ApxⅣA在大肠杆菌中均以包涵体形式表达,表达的重组融合蛋白分别占菌体总蛋白的32%、23%、19%和40%,利用溶菌酶和超声波对重组菌进行分次裂解,除去大部分可溶的菌体蛋白,再用Glutathione Sepharose 4B或Ni-NTA对相应产物进行进一步过柱纯化,最终获得的重组融合蛋白纯度在92%～98%之间,Western-blot的结果表明以上蛋白均具有良好的反应原性,可直接用于ELISA诊断抗原或新型疫苗多肽成分的研究。ApxⅠA的真核表达载体经甲醇诱导,在毕赤酵母GS115中以低水平分泌表达至培养液上清,经40倍浓缩才能检测到目的蛋白,同时从重组酵母总RNA中检测到apxⅠA基因的mRNA,可以证实目的基因发生了转录。经分析,造成apxⅠA基因在毕赤酵母系统中低水平表达的原因可能是:一、组成目的基因的密码子对于毕赤酵母的偏好指数极低;二、大量的酵母稀有密码子使得目的基因中tRNA丰度较低,导致翻译过程出现瓶颈效应;三、目的基因的高AT含量使酵母表达的转录提前终止。猪传染性胸膜肺炎和猪圆环病毒Ⅱ型在临床上共感染较为普遍,都以侵害呼吸系统为主,根据胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因和猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因中最特异最保守的片段分别设计引物和荧光标记TaqMan探针,建立了可同时鉴别诊断猪传染性胸膜肺炎和猪圆环病毒Ⅱ型的实时定量荧光PCR方法,与其它经常发生混合感染的猪繁殖呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(HCV)、伪狂犬病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(HP)、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌等病原体均无交叉反应。该方法用于检测APP和PCV2 DNA的敏感度分别达到1×10~1拷贝和1×10~0拷贝,并且在两种病原的模板浓度相差10~5个拷贝时仍可以同时被检出。建立了APP和PCV2两种单重的TaqMan探针荧光实时定量PCR检测方法。所建立的诊断方法快速便捷、特异性好、敏感度高,对早期的快速诊断和筛查以及病原的净化具有很高的实用价值。