硫化氢对人绒毛膜前列腺素代谢酶的调节及其机制

来源 :第二军医大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lhyhh123
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
早产在我国的发病率约为8.1%,其近远期并发症较多,给家庭和社会带来巨大的精神和经济压力,但由于人类分娩发动的确切机制尚未完全阐明,临床上仍缺乏预测和治疗早产的有效措施。分娩是一个多因素参与的复杂的生理变化过程,妊娠期间大部分时间子宫均处于静息状态,而至妊娠末期,子宫开始出现规律宫缩,并逐渐加强,最终促使胎儿娩出体外。且在该过程中,羊膜、绒毛膜、胎盘等宫内组织来源的前列腺素(prostaglandin, PG)发挥重要作用。目前的研究显示:绒毛膜可高表达前列腺素代谢酶-NAD依赖的15-羟基前列腺素脱氢酶(15-hydroxyprosglandin dehydrogenase, PGDH),由于其处于羊膜和子宫肌之间,妊娠期绒毛膜高表达的PGDH构成一道前列腺素代谢屏障,调控胎膜PG到达子宫肌的量。本实验室前期研究提示分娩启动和H2S有相关性,但进一步的研究尚未进行。因此本课题首先以原代培养的人绒毛膜滋养层细胞为研究对象,首先确定原代培养的细胞中有CBS和CSE的表达,且有产生内源性H2S的能力。然后明确H2S对PGDH表达和生物活性的调节作用,利用RNA干扰技术,进一步明确在人绒毛膜细胞中内源性H2S生成的关键酶。很多的研究发现:microRNA几乎参与了生物的所有病理生理过程,如发育、增殖、凋亡、癌变等,且2009年已经有研究报道,多种microRNA在分娩前后、早产临产前后有差异表达,这就提示我们microRNA参与了分娩启动这一生理过程,且在心血管系统,已经有研究显示,H2S可上调miR-133a的表达。为此,本课题进一步探讨了H2S调控PGDH的microRNA机制。接下来,本课题首先构建了含有PGDH3’UTR双荧光报告基金的质粒及针对microRNA结合位点进行点突变的突变体质粒,利用双荧光报告基因检测系统明确不同rnicroRNA对PGDH3’UTR是否有直接靶作用,并利用Western blot方法探讨H2S是否可通过对以上rnicroRNA的影响实现对PGDH的调节,并最终参与到对局部前列腺素浓度的调节中。最后我们在组织水平检测不同妊娠状态下,CBS、PGDH和不同microRNAs的表达变化情况,从细胞和组织两水平说明microRNA可参与妊娠维持和分娩启动过程中。主要实验结果如下:1、H2S对原代培养人绒毛膜滋养层细胞中PGDH表达和生物活性的影响为说明原代培养的绒毛膜细胞有产生内源性H2S的能力,我们原代培养绒毛膜滋养层细胞,利用PCR和Western blot方法显示细胞中有H2S合成酶CBS、CSE的表达,利用极谱法证明细胞有产生内源性H2S的能力;real time PCR方法显示细胞内CBS的量显著多于CSE;real-time PCR和Western blot及ELISA方法的结果显示,原代培养的人绒毛膜滋养层细胞中H2S可时间和剂量依赖性的促进PGDH表达和生物活性,采用CBS的阻断剂AOAA以及siRNA特异性敲低内源性CBS表达后,L-半胱氨酸上述的促进作用被阻断。以上结果证明:内源性H2S主要在CBS的作用下产生,并发挥对PGDH表达和生物活性的上调作用。2、H2S调节原代培养绒毛膜滋养层细胞中PGDH表达和活性的可能机制在原代培养的绒毛膜滋养细胞中,为明确miR-26a/b和miR-199a是否为PGDH的靶基因,首先,利用瞬时转染的方法将miR-26a、miR-26b和miR-199a的类似物(inhibitors)和抑制物(mimics)转入细胞,结果发现:抑制miR-26b、miR-199a的表达后,PGDH的蛋白表达增加,促进它们的表达后,PGDH的蛋白表达减少;而miR-26a的inhibitor和mimic对PGDH的蛋白表达没有影响,提示PGDH可能是miR-26b和miR-199a的靶基因,而PGDH可能不是miR-26a的靶基因;接下来,构建含有miR-26a/b、miR-199a结合位点的PGDH3’UTR荧光素酶报告基因质粒及其针对上述microRNA结合位点进行点突变的突变体质粒,将其和上述microRNA的类似物共转染细胞,结果发现,miR-26b和miR-199a均可降低PGDH3’UTR的荧光素酶活性,而针对它们的结合位点进行点突变后,上述抑制作用消失,这就证明了PGDH是miR-26b和miR-199a的靶基因。而miR-26a对PGDH3’UTR的荧光素酶活性没有影响,证明了PGDH不是miR-26a的靶基因。为进一步说明H2S是否可通过miR-26b和miR-199a实现对PGDH的上调作用,本课题首先验证了H2S可抑制miR-26b和miR-199a的表达;然后给予miR-26b和miR-199a的类似物预处理细胞后,再给予NaHS和L-半胱氨酸处理细胞,结果发现,H2S对PGDH的上调作用消失了,综合以上结果得出:PGDH是miR-26b、miR-199a的靶基因;H2S能通过抑制miR-26b、 miR-199a的表达,实现对PGDH的上调作用,虽然miR-26a不是PGDH的靶基因,但其表达仍受到H2S的调节。3、足月临产、足月未临产、自发性早产绒毛膜组织中CBS、PGDH和miR-26a、miR-26b、miR-199a的表达为在组织水平验证足月临产和早产临产前后CBS、PGDH和上述microRNA是否发生改变,本课题组收集足月临产、足月未临产、自发性早产绒毛膜组织各10例,利用RT-PCR方法检测,结果显示,与足月未临产组相比,足月临产组的绒毛膜组织中,CBS和PGDH的表达显著减少,miR-26b和miR-199a的表达均显著增加,与足月临产组相比,CBS和PGDH的表达进一步减少,miR-26b和miR-199a的表达均增加更显著;而miR-26a表现出与此相反的趋势。结果与细胞结果一致。结论:CBS在内源性H2S的生成过程中发挥主要的作用;PGDH是miR-26b和miR-199a的靶基因;H2S通过减少miR-26b和miR-199a的表达,实现对PGDH的上调作用,从而减少到达宫体的前列腺素浓度,进而参与到妊娠维持和分娩启动的过程中。
其他文献
目的研究氟硅丙烯酸酯系列(XO, EO)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等三种硬性角膜接触镜材料镜片表面金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌的粘附数量。方法分别将三种硬性角
第一部分:   目的:探讨不同回波时间(timeofecho,TE)对兔肾二维(two-dimensional,2D)磁敏感加权成像(susceptibilityweightedimaging,SWI)的图像信噪比(signaltonoiseratio,SNR)的
目的:探讨经鼻肠梗阻导管应用中的常见并发症及其防治措施。方法:回顾性分析2006~2012年在大连医科大学附属第一医院普外三科应用经鼻肠梗阻导管治疗的88例患者(包括应用经鼻肠
背景和目的:多年来国内外多项临床研究已证实低密度脂蛋白(LDL)与冠心病的发生、发展有密切关系,以及对冠心病经皮冠状动脉介入治疗(PCI)患者的预后明显相关。而近年各指南也
目的:随着糖尿病发病率的逐年升高,其继发的DN(Diabetic Nephropathy,糖尿病肾病)也已经成为ESRD(End-stage Renal Disease,终末期肾病)的主要原因。SWE(Real-time Shear Wave Elast
结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的单一病原菌造成人类死亡的重大疾病,据WHO2015年最新统计结果显示,全球新增感染结核病人高达1040
背景和目的:   新生儿窒息(Asphyxiaofnewborn)是造成小儿死亡及伤残的重要原因之一,窒息缺氧导致机体内环境发生一系列的变化,可引起心、脑、肾等多个重要脏器产生不同程度
目的:探讨独角莲根茎水提取物(AEoTGE)对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KeloidFibroblast,KFB)Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。方法:1、体外采用组织块法提取培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞;2、采用倒置显微镜观察成纤维细胞形态、透射电镜对细胞进行鉴定;3、采用Cell CountingKit8(CCK8试剂盒)法观察不同浓度AEoTGE(7.5,10,15,25,50,75,100g/L)作用于成纤
目的构建霍乱弧菌C7258菌株的hfq基因的缺失株和缺失回补株,分析Hfq蛋白对霍乱弧菌环境适应能力的影响,验证Hfq对环境生存及致病相关基因转录的调控。方法1.PCR方法扩增霍乱
目的:观察糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)大鼠经积雪草酸(asiaticacid,AA)干预后,对Nrf2-ARE信号通路、肾脏组织转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-betal,TGF-β1)及