目的构建霍乱弧菌C7258菌株的hfq基因的缺失株和缺失回补株,分析Hfq蛋白对霍乱弧菌环境适应能力的影响,验证Hfq对环境生存及致病相关基因转录的调控。方法1.PCR方法扩增霍乱弧菌C7258菌株hfq基因的上、下游片段,作为上和下游同源臂,搭桥PCR方法扩增将上、下游同源臂连接。搭桥PCR片段和自杀质粒pWM91分别进行双酶切,之后用连接酶进行连接,获得重组自杀质粒△hfq-pMW91,转化入大肠杆菌SM10λpir株。采用同源重组方法,通过结合将自杀质粒△hfq-pMW91转入霍乱弧菌C7258菌株,利用庆大霉素和氨苄青霉素双抗平板和口pWM91质粒的sacB基因在蔗糖平板上杀死供体菌的方法构建霍乱弧菌C7258菌株的hfq基因的缺失株,并进行PCR鉴定。2.PCR方法扩增hfq基因,获得完整的基因片段△fhq-C,将△fhq-C片段和(?)pUC18克隆载体分别进行XbaI和HidⅢ限制性内切酶双酶切,连接酶连接2酶切产物,转化入大肠杆菌SM10λpir菌株中,获得重组克隆载体△hfq-C-pUC18。将△hfq-C-pUC18重组克隆载体电转入△hfq缺失株中,获得△hfq-C回补株,筛选阳性克隆病用PCR鉴定。3.PCR方法扩增hfq基因,获得hfq-P片段,限制性内切酶BamHI和HIDⅢ分别双酶切hfq-P片段和表达载体pET28a,将酶切产物连接,转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,获得Hfq蛋白表达株hfq-P-BL21(DE3),经IPTG诱导,进行12%SDS-PAGE蛋白电泳。4.通过对野生株、突变株、回补株在富氧、缺氧、胆盐、M9环境下的生长状态,从初始培养到平台期整个过程,每隔1小时测定D600mm,重复三次,用平均值绘成生长曲线,统计学方法比较差异；将野生株、突变株、回补株点在Swim平板上,30℃培养24小时,观察细菌的游动能力,光学显微镜观察野生株、突变株、回补株菌落的透明度及褶皱程度,对野生株、突变株、回补株培养24小时进行结晶紫染色,并测定D570nm；野生株和突变株对不同浓度的去污剂SDS及庆大霉素的抗性能力比较及应对H2O2刺激的敏感性测定,从而比较霍乱弧菌野生株和Hfq突变株在营养受限条件下细菌的生长状况,细菌的运动能力、生物膜形成、外膜抗性和氧化应激能力上的差异。5.针对霍乱弧菌△hfq缺失株表型实验结果,推测可能的相关调控基因,并提取霍乱弧菌野生株和缺失株的RNA,应用荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对Hfq可能调控的相关基因的转录水平进行比较,靶基因涉及鞭毛合成,胞外多糖合成,外膜蛋白,整体调控子以及氧化应激相关。结果1.通过基因敲除-同源重组技术成功构建了霍乱弧菌C7258菌株的△hfq缺株。2.通过融合PCR技术和电转化技术成功构建了霍乱弧菌△hfq缺失株的△hfq-C/△hfq回补株。3.通过融合PCR技术和钙转化技术成功构建了大肠杆菌hfq-P-BL21(DE3)-DH5αλpir蛋白表达株。4.Hfq蛋白激活与鞭毛合成及功能相关基因fliA,flaA,flaC,motA,motX转录从而增强霍乱弧菌的游动能力；但Hfq蛋白不调控galU和galE的转录,提示Hfq蛋白不影响霍乱弧菌的脂多糖结构；Hfq蛋白抑制胞外多糖的合成基因vpsT和vpsA转录,同时抑制VPS合成的转录调节子vpsR转录,达到抑制生物膜形成的作用。5.Hfq蛋白激活外膜蛋白OmpU和OmpT转录,起到提高外膜抗性能力。6.Hfq蛋白抑制katE和sodC的转录,激活ohoB和katG的转录,相对作用的最终结果是Hfq蛋白提高抵御氧化应激的能力。7.Hfq蛋白作为sRNA伴侣分子可能与phoB,HapR,ToxR等调控子一起,协同控制上述基因的表达,从而使霍乱弧菌感知外界环境变化以抵御不利环境而生存下去。结论Hfq蛋白作为RNA伴侣分子,能够通过调控一些生存及致病相关基因的转录进而影响霍乱弧菌的游动性、生物膜形成、氧化应激反应、抗生素抗性等能力,表明Hfq可能与其它调控子一起,在霍乱弧菌的生存、代谢以及致病因子转录的协调控制上起着关键性的作用。