卵巢癌是妇科发病率较高的恶性肿瘤之一,因疾病缺乏典型症状体征,大多数患者发现时即诊断为晚期。因卵巢癌这种疾病具有复发率较高、死亡率较高的特点,这为临床治疗带来了极大的挑战。手术联合化疗是现如今治疗卵巢癌的主要手段,铂类联合紫杉醇是我国一线化疗方案。但在临床治疗过程中,我们发现大多数患者不可避免的会产生铂类耐药性,这对患者的化疗的效果及预后都有很大影响。因此国内外学者在探究开发新药方面付出了很多努力。由于重楼具有抗炎、止血镇痛、调节免疫、副作用小等药理作用,在临床应用较为广泛。近年来研究发现,重楼皂苷对卵巢癌、前列腺癌、胃癌、鼻咽癌和结肠癌等多种癌症细胞具有明显的抗癌活性。一些研究发现重楼皂苷可以调控Bcl-2家族蛋白表达,通过导致线粒体膜电位的崩溃,诱导肿瘤细胞通过线粒体途径凋亡。还有研究发现重楼可以使细胞内活性氧(ROS)产生增加,线粒体膜电位崩溃,伴随着caspase途径的激活以及细胞色素c(Cyto C)从胞浆的释放,诱导线粒体途径凋亡。表明重楼皂苷可能引起肿瘤细胞线粒体功能障碍进而诱导细胞凋亡,但其调控线粒体功能的具体机制尚不明确。因此,探究重楼皂苷Ⅶ对线粒体功能的具体调控机制将为临床治疗卵巢癌提供一定的靶向依据。线粒体是细胞内产生能量的重要细胞器,在信号转导、细胞增殖、分化、自噬和细胞免疫等方面发挥着重要作用。线粒体是动态细胞器,其分裂和融合的不平衡常常导致线粒体结构的改变和功能障碍。虽然线粒体分裂在细胞凋亡中经常出现,有些学者认为分裂是细胞凋亡过程中必不可少的一步,但线粒体分裂和细胞凋亡的具体调控机制尚不清楚。线粒体裂变是一个多步骤的过程,其中GTP酶动力相关蛋白1(DRP1)在线粒体上的募集起着关键作用。研究表明Bax/Bak的活化作用将Bax和DRP1共同定位于发生分裂的线粒体位点,DRP1与线粒体外膜稳定结合,导致线粒体破碎。因此,DRP1在线粒体上的定位可能介导了线粒体动力学与线粒体途径凋亡,而这个过程受其磷酸化水平的调控。蛋白磷酸酶2A(PP2A)是一种重要且普遍存在的丝氨酸苏氨酸磷酸酶,是一种肿瘤抑制剂。PP2A是肿瘤发生的关键负调控因子,影响蛋白合成、细胞增殖、细胞存活、细胞迁移和侵袭性。PP2A在多种恶性肿瘤中失活,包括乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和肺癌。研究表明活化PP2A是对抗癌症的有效方法。研究发现,重楼皂苷Ⅶ可通过调控PP2A/AKT信号轴,抑制顺铂耐药细胞的增殖和侵袭。Drp1可能是AKT的一个直接底物,其活性受蛋白激酶B(AKT)的调控,它们之间的相互作用诱导了Drp1的磷酸化,导致线粒体分裂。因此,我们推断重楼皂苷可以通过调控PP2A/AKT磷酸化DRP1并调控其线粒体定位。这里,我们以Drp1磷酸化改变为中心,用不同浓度重楼皂苷Ⅶ作用于人卵巢癌细胞,探究Drp1在线粒体定位改变与凋亡间的关系,为临床用重楼治疗卵巢癌提供了新的思路。本研究利用不同浓度的重楼皂苷Ⅶ作用人卵巢癌细胞A2780和SKOV3,通过DRP1磷酸化水平的改变,探讨了DRP1线粒体定位的变化与凋亡的关系。阐明重楼皂苷Ⅶ通过PP2A/AKT/DRP1轴调控线粒体分裂,进而促进细胞凋亡,为临床应用重楼皂苷Ⅶ治疗卵巢癌提供了新的思路。实验方法:(1)MTT法检测重楼皂苷Ⅶ对人卵巢癌细胞A2780和SKOV3细胞活力的影响,Annexin V-PI染色后流式细胞术检测细胞凋亡。(2)观察重楼皂苷对卵巢癌细胞线粒体功能的影响。DCFH-DA、JC-1染色流式细胞术检测细胞ROS及线粒体膜电势的变化,利用线粒体提取试剂盒提取线粒体,Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax在线粒体上表达变化,以及检测细胞总蛋白cleaved-caspase3的表达变化。(3)观察重楼皂苷Ⅶ对卵巢癌细胞线粒体动力学的影响。Mitotracker染色后荧光显微镜观察线粒体形态的变化。Western Blot检测Drp1在线粒体定位的变化,以及p-AKT、p-Drp1的变化。PP2A酶联免疫试剂盒检测PP2A活力的变化。(4)探讨重楼皂苷Ⅶ与PP2A/AKT/Drp1信号轴之间的调控关系,以及Drp1发挥的作用。利用PP2A抑制剂LB-100作用于卵巢癌细胞,Western Blot检测Drp1在线粒体定位的变化,Cyto C的释放,以及p-AKT、p-Drp1的变化。PP2A酶联免疫试剂盒检测PP2A活力的变化。Mito Tracker染色后,荧光二抗染色Drp1,荧光显微镜观察二者共定位情况。实验结果:(1)重楼皂苷作用于A2780、SKOV3细胞,显著抑制细胞活力、促进其凋亡并呈剂量依赖方式,重楼皂苷3mM时能够明显抑制细胞活力,并且存在明显促进凋亡作用。(2)重楼皂苷能够明显诱导A2780、SKOV3细胞内ROS生成,导致线粒体膜电势下降。Western Blot检测凋亡相关蛋白表达水平,促凋亡蛋白Bcl-2表达增加,抗凋亡蛋白Bax表达下降,同时激活cleved-caspase3表达增加。(3)重楼皂苷能够影响A2780、SKOV3线粒体动力学,打破其原有的线粒体融合分裂平衡。Mito Tracker染色后显微镜观察到线粒体呈碎片状,Western Blot检测Drp1在线粒体定位增加,同时p-Drp1和p-AKT表达下降。PP2A酶联免疫试剂盒检测PP2A活力增加。(4)抑制PP2A后,能够明显逆转Drp1在线粒体定位水平的增加,并且能够抑制p-Drp1和p-AKT表达下降。实验结论:1.重楼皂苷能够抑制卵巢癌A2780、SKOV3细胞,重楼皂苷促进卵巢癌细胞发生线粒体途径的细胞凋亡。2.重楼皂苷治疗人卵巢癌细胞A2780和SKOV3,通过活化PP2A/AKT去磷酸化pDrp1(ser637)来诱导Drp1线粒体易位,进而诱导线粒体分裂,线粒体Bcl-2家族表达变化和细胞色素C释放到细胞质中,最终导致细胞凋亡。3.调控PP2A/AKT/Drp1轴进而调控Drp1线粒体易位的重楼皂苷可能提供一种新的治疗癌症的方法。