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猪瘟和猪水泡病被世界动物卫生组织(OIE)列入A类传染病名录,世界各国对这两种疫病均采取了严加防制及消灭措施,二者也是国际贸易中必查必检的对象。疫苗接种是预防和控制动物疫病的主要手段。由于传统疫苗在生产中的生物安全隐患和感染与免疫动物难以鉴别等缺陷,利用现代分子生物学技术和免疫学理论,研制新型安全、多联、可鉴别疫苗已成必然之势。基因疫苗以其自身的诸多优点和巨大的应用潜能已成为当今的研究热点之一。本研究通过RT-PCR、套式PCR和亚克隆技术构建了猪水泡病基因疫苗、猪水泡病和猪瘟二联基因疫苗和几种猪瘟基因疫苗,研究其免疫效果,为最终研制成功猪瘟和猪水泡病基因疫苗作技术探索。 1)构建了几种猪瘟基因疫苗:包括E2基因单表达重组质粒pcDNA Es1-11、E2基因双抗原表达质粒pBudCE Es1-11/Es2-22、E2基因与报告基因lacZ共表达质粒pBudCE lacZ/Es2-22、E2基因与猪IFN-γ基因共表达质粒pBudCE Es1-11/IFN-γ、以及E2基因与猪IL-18基因共表达质粒pBudCE Es1-11/IL-18,将以上真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,用原位染色、酶联免疫吸附试验(ELISA)或RT-PCR技术证实它们均可表达外源基因。 2)用这几种猪瘟基因疫苗免疫兔,以阻断ELISA和MTT法监测试验兔抗体水平和淋巴细胞增殖情况,并进行攻毒保护试验。结果,单表达质粒pcDNA Es1-11免疫组中有3/4兔产生E2抗体,攻毒后,4/4完全保护。双抗原表达质粒pBudCE Es1-11/Es2-22免疫组有1/4兔产生抗体,攻毒后,1/4完全保护,1/4部分保护,2/4不保护。pBudCE Es1-11/IL-18利pBudCE Es1-11/IFN-γ免疫组,都未检测到猪瘟抗体(4/4),攻毒后,1/4部分保护,3/4不保护。pBudCE lacZ/Es2-22免疫组(3只)也没出现猪瘟抗体,攻毒后,3/3部分保护。而空载体pcDNA3.1和pBudCE4.1对照组,4/4血清阴性,攻毒后,全部发病。与对照组相比,各免疫组的淋巴细胞均有一定程度的增殖。 3)构建了猪水泡病和猪瘟二联基因疫苗pBudCE E2/P1-11,用它转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光染色和ELISA分别检测到猪水泡病和猪瘟抗原的表达。将其免疫兔,可检测到免疫组兔T淋巴细胞增殖明显;但用阻断ELISA未检测到血消CSFV特异性抗体,用猪瘟活疫苗(Ⅱ)攻击,实验兔有1/4完全保护。用乳鼠中和试验检测,发现所有兔血清SVDV中和抗体均低于1∶4。 4)构建了猪水泡病基因疫苗pcDNA P1,将其转染的BHK-21细胞经荧光染色,可见许多特异性荧光细胞。用其单独(B组)免疫或与pcDNA IFN-γ共同(C组)免疫猪三次,检测免疫前、后猪血清中SVDV特异性抗体的变化,发现免疫后B组和C组各有两只猪产生低水平的抗体,并在攻毒后迅速升高;并对免疫前和攻毒前的猪血清用乳鼠中和试验检测SVDV特异性抗体,结果只有pcDNA P1与pcDNA IFN-γ共同免疫组中有两只猪产生低水平的中和抗体(1∶4),其余猪的中和抗体均小于1∶4。第三次免疫3月后,用猪水泡病香港乳鼠组织毒5mL(2mL蹄叉和3mL颈部肌肉)分两个滴度(10~4 LD50/0.1mL和10~5 LD50/0.1mL)攻击,结果pcDNA P1单独免疫组(B组)有1/4获得完全保护(为10~4/0.1mL攻击),pcDNA P1与pcDNA IFN-γ共同免疫组(C组)中有1/4获得部分保护(为10~5/0.1mL攻击),A和D两个对照组全部发病。