人髓样相关蛋白8 (myeloid-related protein-8,MRP8)是钙结合蛋白S100家族成员之一,具有EF手型结构。MRP8相对分子质量比较小,其单体由2个EF手Ca2+结合区和与之相连的中央铰链区组成,形成螺旋-环-螺旋(Helix-Loop-Helix, H-L-H)结构。其中位于C端的EF手型基序与Ca2+亲和力较高,与Ca2+结合后,该蛋白的构象发生改变,暴露出与靶蛋白相互作用的位点,从而发挥相关的生物学功能。MRP8最早发现于中性白细胞中,被认为是一种具有免疫原性的蛋白。随着研究的深入,发现该蛋白与炎症高度相关,能够募集单核细胞至炎症灶处,是许多急性和慢性炎症的重要促炎因子。另外MRP8／MRP9形成异二聚体在炎症中起了重要作用,该蛋白的血清浓度与炎症活动有关,因此,临床上常用其作为监测疾病发展变化及治疗愈后的指标。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)在革兰氏阴性菌感染的炎症反应中起到了至关重要的作用。该细菌产物能够引起包括巨噬细胞在内的机体免疫系统产生特异性反应。LPS介导的失控性机制的爆发会导致脓毒症或者是全身炎症反应综合症,而后者是一个非传染性的疾病。尽管采取了大量抗菌治疗,但仍然是临床危重患者的重要死因之一,其死亡率高达30～70%。过去十几年中临床利用肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)和白细胞介素1 (interleukin-1, IL-1)拮抗剂治疗都未取得满意效果。近年来的研究表明,致炎刺激LPS等激活的单核／巨噬细胞和内皮细胞会大量释放MRP8,同时坏死组织细胞崩解也释放出大量的MRP8。释放到细胞外的MRP8分子通过进一步激活单核或内皮等细胞,引起大量炎症因子和黏附分子的表达和释放,导致并参与了包括脑组织、肺、胃肠道、关节、心脏等多种脏器的炎症损伤以及广泛的全身性炎症反应甚至死亡。由此可见,MRP8在炎症反应过程中起着重要的作用。尽管目前对于MRP8的生物学功能尚未完全阐明,但是研究发现MRP8蛋白在炎症及肿瘤中的高表达并具有细胞因子样的效应,提示该蛋白在许多与炎症及肿瘤发生发展过程中具有重要的作用。因而MRP8参与炎症、应激等反应的分子基础,特别是作用于细胞相关信号过程成为近年来研究的热点。并且发现,MRP8能与细胞表面的硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan, HSPG)及羧化聚糖发生相互作用。更重要的是研究发现CD36分子、晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)可能是MRP8的细胞表面受体,然而,阻断这些受体并不能完全抑制MRP8的胞内信号传递,这提示细胞表面可能还存在其他的MRP8受体或信号转导方式。结合近年来人们陆续发现一些细胞因子、生长因子或其受体能够被内化而参与胞内的信号反应,我们推测MRP8也能够被效应细胞内化,且其内化活性与其丰富的生物学功能密切相关。内吞是一个复杂并且高效的过程,细胞能够摄取营养物质并且与外界进行联系。内吞小泡的形成过程非常复杂,首先外源性的蛋白有序的富集于细胞膜周围,紧接着质膜上的脂质双分子层发生巨大的变形重构将蛋白包裹形成凹陷的吞噬小泡。内化的过程不仅能够从外界获得物质与能量,同时也能够调节细胞表面某些受体的数量,包括信号通路受体、粘附分子和GPI偶联受体。外源性物质进入细胞的方式主要有三种,经典的依赖包涵素的内吞途径(clathrin-dependent endocytosis),即生物大分子通过与AP-2和其他的受体相互作用而进入细胞。很多生物大分子,包括低密脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、转铁蛋白(transferrin)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、胰岛素等都是通过受体介导的内吞作用内化的。非经典的不依赖包涵素的内吞途径,其中最重要的是胞膜窖(caveolae)介导的内吞。胞膜窖是一种表面分布着特定受体,富含胆固醇及特征性小窝蛋白(caveolin)的微结构。最初研究这个结构在细胞信号转导过程中起重要作用,近年发现其参与了多种细菌和病毒颗粒,如霍乱毒素(cholera toxin, CTx)和猿病毒40 (simian virus 40, SV40)等的内化过程。另一种包涵素非依赖的途径,主要是一些与GPI受体家族结合的分子和糖脂类物质,这类物质具有多形的结构并且不具备坚固的外壳。硫酸肝素蛋白多糖是广泛存在于细胞表面和基底膜的一类糖蛋白,由硫酸肝素(heparan sulfate, HS)和核心蛋白共价连接而成,它们作为共受体调节许多配体的特异性受体的激活,在细胞的机械支持、粘附、运动、增殖、分化和形态形成中起重要作用。除此之外,研究还表明HSPG在内化过程中也具有重要作用,可能是一种普遍的内化机制中的重要分子。基于以上认识,本研究首先构建MRP8与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)融合表达载体,利用共聚焦显微镜观察MRP8是否具有内化活性；接着利用一系列与内化通路相关的抑制剂和荧光染料与MRP8绿色荧光蛋白共同孵育,研究MRP8通过何种内化通路进行内化;之后通过生物信息学的分析研究介导MRP8内化的功能域；进一步研究MRP8内化后的去路问题。最后利用LiquiChip-液相芯片技术检测MRP8经刺激后细胞因子的分泌情况,探讨MRP8内化与炎症的相关性,为后续进一步的深入研究打下基础。通过以上研究,我们得到了如下结论。第一、MRP8以时间和能量依赖性方式先与胞膜结合,进而形成内吞小泡内化进入哺乳细胞。5min时,开始与细胞膜结合,1h左右达到平衡,9h基本代谢完全。第二、MRP8首先可能与细胞膜表面的HSPG上的HS链结合,并依赖其特异性受体,经胞膜窖介导的内吞途径进入细胞,而后细胞骨架参与了该蛋白的细胞内活动；第三、MRP8的内化必须依赖钙离子,由两个EF手型基序协同完成；第四、MRP8内吞进入细胞后,最终被泛素标记进入蛋白酶体降解。而该蛋白上第92位赖氨酸发生泛素化修饰是其降解的主要途径。第五、MRP8的内化与促炎效应是通过两条不同的信号通路完成的,内化的目的是为了降解,从而抑制炎症的持续加重,是机体对抗炎症的一项重要调节机制。MRP8参与了全身炎症反应的过程,与许多炎症及肿瘤有关。本研究对MRP8的内化机制进行了初步研究,且证实MRP8可能通过内化降解,抑制其刺激细胞分泌炎症因子的功能。这些研究结果不但加深了我们对MRP8生物学功能的认识,而且还有可能从根本上影响和改变临床上对脓毒症和失控性全身炎症的认识和治疗方案,因而具有极为重要的基础理论和临床治疗意义。