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目的:观察不同浓度的BDNF对小鼠体外成熟卵母细胞质量及胚胎发育潜能的影响,选取最佳培养浓度,以BDNF为对照,进一步研究补肾调冲方对DOR小鼠体外成熟卵母细胞质量及胚胎发育潜能的影响,为中医应用“肾主生殖”及“冲任学说”治疗DOR提供更有力的依据。 方法: 1.实验一:选取SPF级8-10周龄ICR雌性小鼠40只,每只小鼠在动情前期注射孕马血清(PMSG)IO IU,48小时后处死,采集其未成熟卵母细胞,分别用含有Ong/ml、 lng/ml、5ng/ml、10ng/ml(分别为 BDNF-0组、BDNF-1组、BDNF-5组、BDNF-10组)的BDNF培养液体外培养24小时。利用PCR方法检测卵母细胞内mt DNA拷贝数,采用线粒体荧光探针(mitotracker)检测线粒体定位,采用FITC-PNA对皮质颗粒进行荧光染色,观察皮质颗粒分布。选取SPF级10-12周龄昆明种雄性小白鼠,将雄鼠颈椎脱臼处死,剪碎附睾尾取精,精卵体外受精培养。受精后观察卵母细胞受精、2-细胞及囊胚形成情况。 2.实验二:选取SPF级8-10周龄ICR雌性小鼠40只,按体重分层法随机分配,每组各10只,分为空白组、模型组、BDNF组、中药组。动物模型采用Cy进行造模,模型组、BDNF组和中药组腹腔内一次性注射Cy75mg/kg。空白组、模型组、BDNF组小鼠每日给予生理盐水12mg/kg,中药组小鼠每日给予补肾调冲方水煎剂20mg/kg/d(相当于成人临床等效剂量,按照小鼠体重系数换算)。各干预措施均采用灌胃方式给药,连续4周。每只小鼠在动情前期注射PMSG10IU,48小时后处死,采集其未成熟卵母细胞,空白组、模型组、中药组在KSOM-AA培养液中进行培养,BDNF组在培养液中添加5ng/ml的BDNF进行培养,各组均培养24小时。利用PCR方法检测卵母细胞mt DNA拷贝数,采用线粒体荧光探针(mitotracker)检测线粒体定位,采用FITC-PNA对皮质颗粒进行荧光染色,观察皮质颗粒分布。选取SPF级10?12周龄昆明种雄性小白鼠,将雄鼠颈椎脱白处死,剪碎附睾尾取精,精卵体外受精培养。受精后观察卵母细胞受精、2-细胞及囊胚形成情况。 结果: 1、实验一 1.1各组小鼠体外成熟卵母细胞质量比较:(l)mtDNA拷贝数:各组的mtDNA拷贝数相比差异无统计学意义。(2)线粒体定位:BDNF-5组和BDNF-10组中IVM卵母细胞的线粒体均匀分布的比例分别显著高于BDNF-0组和BDNF-1组。BDNF-0组与 BDNF-1组、BDNF-5组与BDNF-10组组间相比差异均无统计学意义,BDNF-0组与 BDNF-5组、BDNF-0组与 BDNF-10组、BDNF-1组与 BDNF-5组、BDNF-1组与 BDNF-10组组间相比差异均有统计学意义。(3)皮质颗粒分布:BDNF-5组和BDNF-10组皮质颗粒呈III级分布的比率明显高于BDNF-0组和BDNF-1组。BDNF-0组与BDNF-1组、 BDNF-5组与BDNF-10组组间相比差异均无统计学意义,BDNF-0组与BDNF-5组、 BDNF-0组与 BDNF-10组、BDNF-1组与 BDNF-5组、BDNF-1组与 BDNF-10组组间相比差异均有统计学意义。 1.2各组小鼠卵母细胞发育能力的比较:(1)卵母细胞受精率:各组相比差异无统计学意义。(2)2-细胞率和囊胚率:BDNF-5和BDNF-10组的IVM卵母细胞的2-细胞率和囊胚率显著高于BDNF-0组和BDNF-1组。BDNF-0组与BDNF-1组、BDNF-5组与BDNF-10组组间相比差异均无统计学意义,BDNF-0组与BDNF-5组、BDNF-0组与 BDNF-10组、BDNF-1组与BDNF-5组、BDNF-1组与BDNF-10组组间相比差异均有统计学意义。 2、实验二 2.1补肾调冲方对各组小鼠体外成熟卵母细胞质量比较:(1) mtDNA拷贝数:空白组、 BDNF组、中药组mtDNA拷贝数均明显高于模型组,相比差异有统计学意义。空白组、 BDNF组、中药组三组之间两两比较差异均无统计学意义。(2)线粒体定位:空白组、 BDNF组、中药组线粒体均匀分布比例均明显高于模型组,相比差异均有统计学意义。空白组、BDNF组、中药组三组之间两两比较差异均无统计学意义。(3)皮质颗粒分布:空白组、BDNF组、中药组皮质颗粒处于III级分布的比例明显高于模型组,相比差异均有统计学意义。空白组、BDNF组、中药组三组之间两两比较差异均无统计学意义。 2.2各组小鼠卵母细胞发育能力的比较:(1)卵母细胞受精率:空白组、BDNF组、中药组的受精率均较模型组明显增高,相比差异均有统计学意义;空白组、BDNF组、中药组三组之间两两比较,差异均无统计学意义。(2)2-细胞率和囊胚率:空白组、 BDNF组、中药组的受精率均较模型组明显增高,相比差异均有统计学意义;空白组、 BDNF组、中药组三组之间两两比较,差异均无统计学意义。 结论: 1.BDNF可以促进外成熟卵母细胞细胞质的成熟,提高卵母细胞质量。 2.BDNF可以提高胚胎发育潜能。 3.经过不同浓度对比,体外成熟培养液中添加5ng/ml的B D N F即可提高卵母细胞质量和胚胎发育潜能。 4.补肾调冲方和BDNF均可以促进D O R小鼠体外成熟卵母细胞质成熟,提高卵母细胞质量。 5.补肾调冲方和BDNF均可以提高D O R小鼠胚胎发育潜能。 6.在提高IVM中卵母细胞质量和胚胎发育潜能方面,补肾调冲方与BDNF具有相似的效果,为中医“肾主生殖”及“冲任学说”提供理论依据,也为临床上中医药治疗DOR、介入辅助生殖技术提供了新的科学依据。