肝纤维化是由伤口长期愈合过程中的疤痕组织过度积累造成的,肝纤维化过程中还伴有肝血管结构的严重扭曲,尤其是在形成连接传入血管和传出血管的结缔组织隔膜上。这些会导致肝功能恶化,例如清除毒素和合成维持身体功能所需的关键蛋白质、脂质和碳水化合物的能力受损,并最终发展为肝硬化。晚期纤维化在没有明显的临床或实验室化学肝功能衰竭迹象的情况下发生原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的风险为1-7%。最近很多研究发现,在肝纤维化的发生过程中肝星形细胞的活化发挥着很重要的作用,因此,从肝脏中去除或灭活活化的HSCs可能是肝脏从肝纤维化中恢复的一个重要手段。Kazal I型丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine protease inhibitor,kazal type 1,SPINK1）,是Kazal等从胰腺中分离出来的,SPINK1与表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）的空间结构十分相似,研究发现SPINK1可以同EGF的受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）结合进而对细胞增殖与凋亡、炎症反应以及肿瘤的发生与发展进行调控。我们实验室在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型的基因表达谱中发现SPINK1在造模3周、6周、9周的表达均显著上调,随后通过基因添加和重组蛋白处理提高内源性和外源性SPINK1水平后,发现HSC-T6细胞的细胞活力、增殖、周期、迁移能力均显著提高。而SPINK1敲降对HSC-T6细胞的激活是否有影响还未见报,因此,本课题拟探究siRNA干涉SPINK1基因对大鼠肝星形细胞HSC-T6生物学作用的影响及其对HSC-T6细胞的分子调控机制。本课题首先根据SPINK1的m RNA设计出三段不同的siRNA干涉序列,采用Western Blot和q RT-PCR对三段siRNA进行筛选以找出干涉效果最佳的片段,然后用免疫荧光检测siRNA干涉效率;用CCK8、Ed U、Transwell小室法和划痕实验检测SPINK1敲降后HSC-T6的活力、增殖、迁移和侵袭能力;用PI染色法检测HSC-T6周期变化;AnnexinⅤ-FITC/PI荧光双染检测HSC-T6凋亡,随后通过Western blot的方法对细胞增殖、信号通路以及HSC-T6细胞活化相关蛋白的表达情况进行检测。结果表明在HSC-T6细胞中SPINK1基因敲降会显著抑制HSC-T6的活力、增殖、周期、迁移和侵袭能力,显著提升HSC-T6的凋亡率,而且,对与HSC-T6增殖相关的PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路中的蛋白磷酸化也有较显著的抑制作用,说明SPINK1调控HSC-T6的增殖可能是通过PI3K-AKT和JAK-STAT这两条信号通路进行的。此外,与HSC-T6细胞活化相关蛋白α-SMA和COL1A1发生低表达,TGF-β信号通路中的蛋白磷酸化降低,显示SPINK1可能是通过TGF-β信号通路调控HSC-T6的细胞活化。因此,我们又添加LY294002、HY-40354和SB-431542信号通路抑制剂,采用CCK8、EDU、流式细胞仪和Western Blot等实验来验证上述猜测。结果证明SPINK1在HSC-T6细胞中通过PI3K-AKT信号通路控制细胞生长,并且通过TGF-β信号通路调控HSC-T6的细胞活化。