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目的：创伤性脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)是世界范围内关注的公共卫生问题之一，目前尚无全面的治疗干预措施。水通道蛋白-4(Aquaporin-4,AQP4)是中枢神经系统(central nervous system,CNS)中分布最为丰富广泛的水通道蛋白，其与脑水肿、血脑屏障完整性以及星形胶质细胞的功能密切相关。米诺环素是一种广谱半合成四环素类抗生素，其脂溶性较好，能有效通过血脑屏障，在CNS疾病中中具有抗炎、抗凋亡、血管保护和神经保护作用。然而，米诺环素干预治疗TBI的潜在机制尚不清楚，尤其是米诺环素与AQP4在TBI模型中的关系从未被讨论过。本项目旨在进一步探索米诺环素与AQP4的关系对于TBI后继发性损伤的保护作用，为创伤性脑损伤后血脑屏障修复及水肿减轻提供一种新的治疗策略。
方法：动物实验：将6-8周雄性B6小鼠随机分为假手术组(s ha m组)、脑损伤组(TBI组)、脑损伤给药组(TBI+Mino组)。后两组小鼠使用脑立体定位仪及颅脑打击器，建立B6小鼠的脑创伤模型。腹腔注射荧光素钠(NaFI,376kDa)，使用小动物活体成像仪检测米诺环素是否有效改善T BI后的血脑屏障损伤。通过测量小鼠全脑干湿重比例，探究米诺环素是否有效缓解T BI后的脑水肿。同时收集以上三组小鼠损伤后3天的大脑皮层组织，通过TUNEL，FJ-B等免疫染色以及细胞凋亡相关指标的western blot分析，探究米诺环素对神经元凋亡的影响。通过血管白蛋白渗漏指标Albumin的免疫荧光和基质金属蛋白酶MMP-9的western blot分析，评价米诺环素对血脑屏障受损后的调控，同时结合对屏障紧密连接蛋白ZO-1,Occludin和Claudin-5表达水平的分析，进一步探究米诺环素对屏障功能中紧密连接结构的影响。通过对水通道蛋白AQP4的western blot以及AQP4和星形胶质细胞标志蛋白GFAP的免疫荧光共定位分析，探讨米诺环素对脑损伤后AQP4的表达水平和定位情况的影响。通过对GFAP的western blot、免疫荧光和免疫组化染色分析，评价米诺环素对脑损伤后星形胶质细胞的活化及形态变化的影响。基于以上研究结果，使用AQP4激动剂氰胺(Cyanamide,CYA)和AQP4特异性抑制剂TGN-020干预小鼠体内AQP4水平，通过免疫蛋白印迹法分析三种代表性紧密连接蛋白的表达水平，同时通过AQP4与GFAP的免疫荧光共定位和GFAP的免疫组织化学染色分析，进一步验证米诺环素对脑损伤后的血脑屏障和星形胶质细胞功能的保护作用是否来源于对AQP4的综合调控。细胞实验：使用谷氨酸盐(Glutamate,Glu)诱导原代星形胶质细胞的肿胀，模拟体内脑损伤后导致的星形胶质细胞水肿，探究米诺环素对星形胶质细胞水肿的调控作用。同时使用小干扰RNA(siRNA)沉默星形胶质细胞内的AQP4表达，通过免疫荧光染色观察G lu是否仍会导致星形胶质细胞肿胀，进一步证实米诺环素减轻损伤后星形胶质细胞肿胀的作用机制。
结果：(1)在动物组织实验中，HE病理染色切片染色结果表明米诺环素可以有效保护损伤后的宏观的脑组织完整性。TUN EL荧光染色和细胞凋亡相关指标的western blot检测结果说明米诺环素能有效抑制TBI后导致的细胞凋亡。同时尼氏染色和FJ-B荧光染色结果证实了米诺环素能够最终缓解神经元的凋亡。(2)从小鼠全脑荧光素钠透过实验，Albumin和MMP-9的免疫荧光染色以及western blot检测结果中，发现米诺环素能够很好地缓解TBI后血脑屏障的损伤和开放，抑制脑损伤导致的屏障通透性的增加。通过对屏障紧密连接蛋白的western blot结果以及ZO-1与血管内皮细胞标志物CD31的荧光共定位结果分析，发现米诺环素治疗可以有效提高紧密连接蛋白的表达水平，优化损伤后的紧密连接结构。(3)根据小鼠全脑干湿重比的测定结果，发现米诺环素能够很好地缓解TBI导致的脑组织水肿。同时在水通道蛋白AQP4的western blot检测以及与GFAP的荧光共定位分析中，发现米诺环素治疗能显著抑制损伤后AQ P4的过度表达，并有效逆转TBI后AQ P4在星形胶质细胞末足上的去极化作用。(4)根据小鼠体内星形胶质细胞标志蛋白GFAP的相关免疫荧光，western blot和免疫组化染色的结果分析，发现米诺环素能够有效缓解损伤导致的星形胶质细胞水肿，调节相对的星形胶质细胞胞体大小，从而抑制过度肿胀导致的细胞毒性和星形胶质细胞凋亡(胀亡)。(5)通过使用AQP4激动剂和抑制剂，发现调控体内AQP4的表达水平可以有效地调节紧密连接蛋白的表达，且抑制损伤后AQ P4的过度上调能促进AQ P4在星形胶质细胞末足上的极化，进而抑制细胞毒性水肿，缓解星形胶质细胞功能障碍。(6)在体外原代星形胶质细胞水肿模型中，米诺环素可以有效缓解Glu刺激诱导的星形胶质细胞肿胀。通过siRNA沉默细胞体内的AQP4，发现在Glu刺激下的星形胶质细胞胞体肿胀进程被阻断，且米诺环素对于星形胶质细胞体积的调节功能丧失，进一步证实了AQP4是调节星形胶质细胞肿胀的关键靶点。
结论：当前研究结果证明米诺环素可以通过抑制脑创伤后AQ P4的过度表达以及恢复AQ P4在星形胶质细胞末足上的极化，缓解血脑屏障损伤和星形胶质细胞功能紊乱，改善损伤区域的微环境，最终减少神经元和星形胶质细胞的凋亡，促进脑损伤后的功能恢复。该研究强调了AQ P4是米诺环素干预治疗创伤性脑损伤的关键靶点，同时也为创伤性脑损伤后的治疗提供了一种新的策略。
方法：动物实验：将6-8周雄性B6小鼠随机分为假手术组(s ha m组)、脑损伤组(TBI组)、脑损伤给药组(TBI+Mino组)。后两组小鼠使用脑立体定位仪及颅脑打击器，建立B6小鼠的脑创伤模型。腹腔注射荧光素钠(NaFI,376kDa)，使用小动物活体成像仪检测米诺环素是否有效改善T BI后的血脑屏障损伤。通过测量小鼠全脑干湿重比例，探究米诺环素是否有效缓解T BI后的脑水肿。同时收集以上三组小鼠损伤后3天的大脑皮层组织，通过TUNEL，FJ-B等免疫染色以及细胞凋亡相关指标的western blot分析，探究米诺环素对神经元凋亡的影响。通过血管白蛋白渗漏指标Albumin的免疫荧光和基质金属蛋白酶MMP-9的western blot分析，评价米诺环素对血脑屏障受损后的调控，同时结合对屏障紧密连接蛋白ZO-1,Occludin和Claudin-5表达水平的分析，进一步探究米诺环素对屏障功能中紧密连接结构的影响。通过对水通道蛋白AQP4的western blot以及AQP4和星形胶质细胞标志蛋白GFAP的免疫荧光共定位分析，探讨米诺环素对脑损伤后AQP4的表达水平和定位情况的影响。通过对GFAP的western blot、免疫荧光和免疫组化染色分析，评价米诺环素对脑损伤后星形胶质细胞的活化及形态变化的影响。基于以上研究结果，使用AQP4激动剂氰胺(Cyanamide,CYA)和AQP4特异性抑制剂TGN-020干预小鼠体内AQP4水平，通过免疫蛋白印迹法分析三种代表性紧密连接蛋白的表达水平，同时通过AQP4与GFAP的免疫荧光共定位和GFAP的免疫组织化学染色分析，进一步验证米诺环素对脑损伤后的血脑屏障和星形胶质细胞功能的保护作用是否来源于对AQP4的综合调控。细胞实验：使用谷氨酸盐(Glutamate,Glu)诱导原代星形胶质细胞的肿胀，模拟体内脑损伤后导致的星形胶质细胞水肿，探究米诺环素对星形胶质细胞水肿的调控作用。同时使用小干扰RNA(siRNA)沉默星形胶质细胞内的AQP4表达，通过免疫荧光染色观察G lu是否仍会导致星形胶质细胞肿胀，进一步证实米诺环素减轻损伤后星形胶质细胞肿胀的作用机制。
结果：(1)在动物组织实验中，HE病理染色切片染色结果表明米诺环素可以有效保护损伤后的宏观的脑组织完整性。TUN EL荧光染色和细胞凋亡相关指标的western blot检测结果说明米诺环素能有效抑制TBI后导致的细胞凋亡。同时尼氏染色和FJ-B荧光染色结果证实了米诺环素能够最终缓解神经元的凋亡。(2)从小鼠全脑荧光素钠透过实验，Albumin和MMP-9的免疫荧光染色以及western blot检测结果中，发现米诺环素能够很好地缓解TBI后血脑屏障的损伤和开放，抑制脑损伤导致的屏障通透性的增加。通过对屏障紧密连接蛋白的western blot结果以及ZO-1与血管内皮细胞标志物CD31的荧光共定位结果分析，发现米诺环素治疗可以有效提高紧密连接蛋白的表达水平，优化损伤后的紧密连接结构。(3)根据小鼠全脑干湿重比的测定结果，发现米诺环素能够很好地缓解TBI导致的脑组织水肿。同时在水通道蛋白AQP4的western blot检测以及与GFAP的荧光共定位分析中，发现米诺环素治疗能显著抑制损伤后AQ P4的过度表达，并有效逆转TBI后AQ P4在星形胶质细胞末足上的去极化作用。(4)根据小鼠体内星形胶质细胞标志蛋白GFAP的相关免疫荧光，western blot和免疫组化染色的结果分析，发现米诺环素能够有效缓解损伤导致的星形胶质细胞水肿，调节相对的星形胶质细胞胞体大小，从而抑制过度肿胀导致的细胞毒性和星形胶质细胞凋亡(胀亡)。(5)通过使用AQP4激动剂和抑制剂，发现调控体内AQP4的表达水平可以有效地调节紧密连接蛋白的表达，且抑制损伤后AQ P4的过度上调能促进AQ P4在星形胶质细胞末足上的极化，进而抑制细胞毒性水肿，缓解星形胶质细胞功能障碍。(6)在体外原代星形胶质细胞水肿模型中，米诺环素可以有效缓解Glu刺激诱导的星形胶质细胞肿胀。通过siRNA沉默细胞体内的AQP4，发现在Glu刺激下的星形胶质细胞胞体肿胀进程被阻断，且米诺环素对于星形胶质细胞体积的调节功能丧失，进一步证实了AQP4是调节星形胶质细胞肿胀的关键靶点。
结论：当前研究结果证明米诺环素可以通过抑制脑创伤后AQ P4的过度表达以及恢复AQ P4在星形胶质细胞末足上的极化，缓解血脑屏障损伤和星形胶质细胞功能紊乱，改善损伤区域的微环境，最终减少神经元和星形胶质细胞的凋亡，促进脑损伤后的功能恢复。该研究强调了AQ P4是米诺环素干预治疗创伤性脑损伤的关键靶点，同时也为创伤性脑损伤后的治疗提供了一种新的策略。