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布鲁氏菌(Brucella)是一种对人和家畜都具有强致病性的胞内寄生菌,一旦感染可导致人畜流产、睾丸炎、风湿性关节炎等症状。在我国,新疆及内蒙古是畜牧大省,近年来,该病在这两个省中的发病呈上升趋势。因此,对类泛素在布鲁氏菌介导的细胞凋亡中的机制研究具有重要意义。目的:本实验以布鲁氏菌宿主细胞小鼠巨噬细胞内类泛素SUMO-1/2/3和类泛素偶联酶Ubc-9基因为研究对象,分别构建SUMO-1/2/3和Ubc-9基因的干扰和过表达小鼠巨噬细胞模型;羊种布鲁氏菌16M侵染小鼠巨噬细胞,探究其对布鲁氏菌胞内生存和布鲁氏菌诱导的巨噬细胞凋亡的影响,初步筛选布鲁氏菌影响类泛素化修饰的毒力因子。方法:(1)布鲁氏菌16M、布鲁氏菌M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后,利用q RT-PCR方法和Western blotting分别检测侵染4、8、12和24 h细胞中类泛素SUMO-1、SUMO-2/3、Ubc-9 m RNA转录水平和蛋白表达水平;(2)构建针对类泛素p LEX-SUMO-1、p LEX-SUMO-2/3、Ubc-9基因的过表达和干扰细胞模型,布鲁氏菌16M侵染细胞模型,流式细胞仪检测小鼠巨噬细胞的凋亡率,分别进行CFU计数,检测布鲁氏菌的胞内存活;(3)提取布鲁氏菌16M脂多糖LPS,以0.1、1和10 ng/μl的浓度梯度侵染小鼠巨噬细胞,分别在30min、1和3 h收集细胞;布鲁氏菌16M-△Vir B2侵染细胞,在1、3和5 h收集细胞,q RT-PCR和Western bloting分别检测类泛素SUMO-1、Ubc-9 m RNA转录及蛋白表达水平。结果:(1)布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞后,能够引起细胞中类泛素SUMO-1/2/3以及类泛素化修饰偶联酶Ubc-9规律的变化,随着侵染的进行,其表达开始上升,在8 h达到最高,随后开始下降,12 h后又开始上调,在整个过程中,表达量均低于正常水平,差异显著(P<0.05)。SUMO-2/3和Ubc-9变化趋势相似,在侵染后,二者表达量高于正常水平,差异显著(P<0.05),其中,在8 h表达量最高,随后开始下降,在12 h表达量最低;(2)构建好的细胞模型经q RT-PCR检测后,三对sh RNA干扰片段干扰效率为:SUMO-1:38.0%、75.0%、53.1%,Ubc9:48.3%、95.2%;过表达模型p LEX-SUMO-1和p LEX-SUMO-2/3两个基因的表达量分别升高了183%和223%,CFU实验显示,p LEX-SUMO-2/3组log CFU值显著低于对照组,PLL3.7-S1和PLL3.7-U1组高于对照组,差异显著。细胞凋亡率流式细胞仪检测结果显示,p LEX-SUMO-2/3组细胞凋亡率与对照组相比显著升高,PLL3.7-S1和PLL3.7-U1组细胞凋亡率与对照组相比显著降低;随着的侵染时间的变化,每组细胞凋亡率显著升高。(3)布鲁氏菌16M脂多糖LPS对细胞中类泛素SUMO-1、偶联酶Ubc9的表达没有影响。然而,布鲁氏菌16M-△Vir B2侵染小鼠巨噬细胞后,与对照组相比,缺失株侵染组细胞中SUMO-1和Ubc-9的表达量都明显提高,差异极显著(P﹤0.01)。结论:以上所有的研究结果表明,布鲁氏菌感染影响了小鼠巨噬细胞SUMO系统,且这种作用与布鲁氏菌四型分泌系统存在一定联系;构建的p LEX-SUMO-1、p LEX-SUMO-2/3慢病毒过表达质粒经293T细胞包装成慢病毒感染小鼠巨噬细胞后,能够引起细胞中SUMO-1、SUMO-2/3表达量的提高,SUMO减少了小鼠巨噬细胞中布鲁氏菌的数量,提高了细胞凋亡数量,以利于机体其他免疫系统杀灭胞内菌;相反的是,当沉默了细胞中SUMO-1和Ubc-9,细胞中布鲁氏菌生存能力得到了提高,细胞凋亡率发生了降低,这有利于布鲁氏菌的在胞内的持续存在;提纯的布鲁氏菌LPS对细胞中SUMO-1、Ubc9的表达没有影响;布鲁氏菌16M-△Vir B2感染细胞,可提高细胞中SUMO-1、Ubc9的表达量,可初步推测,布鲁氏菌通过四型分泌系统向宿主细胞分泌效应蛋白,干扰类泛素化修饰。综上所述,小鼠SUMO-1/2/3和Ubc-9在布鲁氏菌侵染过程中对于布鲁氏菌胞内生存以及布鲁氏菌诱导的细胞凋亡有重要作用。