冠心病(CHD)是一种慢性免疫炎症性疾病，慢性免疫炎症反应损伤血管，引起脂质浸润，平滑肌细胞增殖，导致斑块形成，炎症免疫反应又可以促进斑块的发展，但是，免疫炎症反应在CHD中的具体机制还不完全清楚。Toll样受体(TLR)是1988年Hashimoto等在果蝇中发现一种属于I型跨膜蛋白的受体，Medzhitov等在1997年首次鉴定出与果蝇同源的第一个人类细胞表面的Toll样蛋白，现今已经克隆的人TLR家族成员至少有10个，分别命名为TLR1-10。TLR在人许多组织细胞中均有表达，但主要还是表达在单核细胞、淋巴细胞和树突状细胞上。TLR与外源性和内源性配体结合，通过其介导的信号转导途径触发免疫和炎症反应。TLR在免疫炎症性疾病的发生、发展中的作用已开始受到人们的关注。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时定量-聚合酶链反应(Real-time PCR)和流式细胞术检测健康人和CHD患者外周血单个核细胞中TLR1-10 mRNA的组成型表达，分析TLR1-10 mRNA的表达与冠心病危险因素积聚性的关系。进一步探讨冠心病危险因素氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)和高糖对体外培养单个核细胞TLR1-10 mRNA的表达及其下游炎症因子肿瘤坏死因子-a(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的影响。为进一步揭示CHD的发病机制，寻求有效的防治措施提供理论基础。　　 第一部分人外周血单个核细胞Toll样受体的表达　　 目的:观察人外周血单个核细胞TLR1-10 mRNA各亚型的表达状况，为进一步研究TLR功能寻找合适细胞。　　 方法:分离人外周血中的单个核细胞，用RT-PCR和Real-time PCR检测健康人单个核细胞中TLR1-10 mRNA的组成型表达。　　 结果:　　 1.RT-PCR扩增结果以单个核细胞mRNA为模板，扩增cDNA片段，经质量分数1.2％琼脂糖凝胶电泳显示:1-10泳道均有核酸条带，且条带的大小与TLR1-10引物设计的理论值一致，说明人单个核细胞有TLR1-10 mRNA的组成型表达。　　 2.Real-time PCR检测TLR1-10的组成型表达将单个核细胞的mRNA逆转录成cDNA后，以同一管cDNA为模板，同时扩增TLR1-10和GAPDH。这样可减少因模板不同所造成的TLR1-10之间的差异。TLR1、2、4、6的mRNA表达量较高，而TL，RTmRNA的表达量相对较少。　　 结论:人外周血中单个核细胞有TLR1-10mRNA的表达，单个核细胞可作为研究TLR功能的细胞。　　 第二部分冠心病外周血单个核细胞Toll样受体的表达及其与冠心病危险因素聚集性的关系　　 目的:观察CHD患者外周血单个核细胞TLR1-10的表达状况及其与CHD危险因素聚集性的关系，探寻TLR1-10在CHD发病机制中的作用。　　 方法:急性冠脉综合征(ACS)、慢性心肌缺血综合征(CIS)患者和正常健康者各30例，用流式细胞术检测外周血单个核细胞TLR1-10的表达。搜集血压、血糖、血脂，吸烟史及家族史等危险因素，计算危险因素积分。应用方差分析TLR1-10在各组中的阳性率情况，相关分析研究CHD危险因素积分与TLR1-10阳性率的关系。　　 结果:在急性ACS组、CIS组中，外周血单个核细胞TLR2-5表达的阳性率均显著高于健康对照组，TLR2、4、5在ACS组的表达阳性率均显著高于CIS组，其他亚型在各组间无显著差异。相关分析显示，外周血中单个核细胞TLR2-5表达的阳性率与CHD危险因素积分呈正相关，其相关系数分别为0.438，0.632，0.303，0.526，P<0.05或P<0.01。　　 结论: CHD外周血中单个核细胞TLR2-5表达的阳性增多，TLR2、4、5还可能反映CHD的严重程度；TLR2-5的表达与CHD危险因素聚集性有关。　　 第三部分氧化性低密度脂蛋白对人单个核细胞Toll样受体表达及炎症介质的影响　　 目的:探讨ox-LDL对单个核细胞TLR1-10表达的影响及及其下游炎症因子TNF-α、IL-6的调控作用。　　 方法:用Real-timePCR检测ox-LDL刺激单个核细胞后，TLR1-10 mRNA表达的变化；结合抗体阻断实验，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液中TNF-α和IL-6的含量。　　 结果:ox-LDL刺激可上调入单个核细胞TLR2、4 mRNA的表达。经ox-LDL刺激后，单个核细胞分泌TNF-α、IL-6上升，抗体阻断TLR2、4，可以减少ox-LDL诱导的TNF-α、IL-6分泌。　　 结论:ox-LDL可能是Toll样受体2、4的内源性配体，ox-LDL可通过Toll样受体2、4信号通路调节单个核细胞炎性细胞因子的生成。　　 第四部分高糖对人单个核细胞Toll样受体表达及炎症介质的影响　　 目的:探讨在高浓度葡萄糖的条件下，体外培养单个核细胞TLR1-10的表达及炎症因子TNF-α、IL-6的变化，进一步探索高糖在动脉粥样硬化免疫炎症反应中的作用。　　 方法:用Real-timePCR.检测在高浓度葡萄糖的条件下，单个核细胞TLR1-10mRNA表达的变化。结合抗体阻断实验，用酶联免疫吸附法检测培养上清液中TNF-α和IL-6的表达。　　 结果:高浓度葡萄糖可上调TLR3、5 mRNA的表达。同时高浓度葡萄糖促进TNF-α、IL-6的生成，抗体阻断TL，R3、5后，可以减少高浓度葡萄糖诱导的TNF-α、IL-6分泌。　　 结论:高浓度葡萄糖上调TLR3、5mRNA的表达，高浓度葡萄糖通过上调TLR3、5 mRNA的表达而促进TNF-α、IL-6的生成。